采用小米粒培養(yǎng)基構(gòu)建香菇遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、香菇（Lentinula edodes）是世界上最著名的食用菌之一，是世界第二大食藥用真菌，產(chǎn)量?jī)H次于雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），在中國(guó)已有近千年的栽培歷史[1]。由于其突出的食藥作用和價(jià)值，人們對(duì)香菇的需求量明顯上升，從而促進(jìn)了香菇產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，自1987年香菇總產(chǎn)量第一次超過日本以來，中國(guó)一直保持著世界第一香菇大國(guó)的地位[2]。不過與發(fā)展迅猛的香菇產(chǎn)業(yè)相比，香菇的遺傳轉(zhuǎn)化研究較為落后。隨著兩個(gè)香菇全基因組測(cè)序的完

2、成和公布[3-4]，香菇的遺傳及功能基因研究將成為熱點(diǎn)。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是運(yùn)用分子生物學(xué)相關(guān)方法和基因工程相關(guān)方法將本來不屬于受體菌株基因組的基因片段插入到受體基因組并整合，再通過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，最終可以達(dá)到定向的改變受體菌株或者細(xì)胞生理生化特性的目的。因此，穩(wěn)定、高效、便捷的遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建將具有重要意義和價(jià)值。
　　本文將探索以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系在香菇原生質(zhì)體單核體菌株中進(jìn)行隨機(jī)插入突變的研究。通過香菇菌絲

3、對(duì)潮霉素的抗性試驗(yàn)，確定了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化初篩濃度為10mg/L，復(fù)篩濃度為12mg/L。通過對(duì)比在不同頭孢噻肟鈉Cef濃度下香菇菌絲的生長(zhǎng)情況，確定了Cef的最佳抑制農(nóng)桿菌的濃度為600mg/L。構(gòu)建的質(zhì)粒pYN6982和GPiE以潮霉素抗性基因hyg作為篩選標(biāo)記基因，以增強(qiáng)型熒光蛋白基因egfp作為報(bào)告基因，以農(nóng)桿菌EHA105和LBA4404為介導(dǎo)，同時(shí)轉(zhuǎn)化了3個(gè)香菇單核體菌株。
　　香菇受體菌絲創(chuàng)新性地采用小米粒培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和

4、轉(zhuǎn)化，采用小米粒培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲不需要用打孔器選取直徑相同的菌塊，每粒小米粒都是大小均勻的個(gè)體，可以直接挑取使用，也無需再接種于鋪有無菌玻璃紙的MYG固定培養(yǎng)基中，不易污染雜菌。農(nóng)桿菌侵染菌絲后，小米粒方便挑取，相較于常用的PDA菌塊或菌絲球的方法，這種方法可更快捷得到更多的易于分散的受體材料，并可更加方便、快捷的統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率。
　　受體菌絲經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染，共培養(yǎng)階段培養(yǎng)，通過潮霉素抗性篩選，經(jīng)PCR以及測(cè)序驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子中含有潮霉素

5、抗性基因的片段。經(jīng)過熒光顯微觀察，經(jīng)轉(zhuǎn)化的香菇菌絲體內(nèi)可以觀測(cè)到綠色熒光，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對(duì)照菌株則沒有熒光信號(hào)的產(chǎn)生，表明增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)化香菇菌絲中得到了表達(dá)，再經(jīng)過轉(zhuǎn)化子的有絲分裂穩(wěn)定性試驗(yàn)得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。對(duì)部分香菇轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)觀察試驗(yàn)，與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照香菇菌絲相比，發(fā)現(xiàn)小部分轉(zhuǎn)化子菌落的形態(tài)和生長(zhǎng)速度有所差異，可能是T-DNA的插入破壞了轉(zhuǎn)化子基因組中與菌落形態(tài)相關(guān)的功能基因，從而導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化子和對(duì)照

6、菌絲的差異。
　　本研究探索出一種采用小米粒培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲并進(jìn)行轉(zhuǎn)化的新方法，并且從菌絲在小米粒培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌類型、質(zhì)粒上啟動(dòng)子類型、農(nóng)桿菌侵染過程中超聲時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和溫度等方面進(jìn)行探索和優(yōu)化。同時(shí)比較了含有不同啟動(dòng)子的質(zhì)粒在相同農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)化效率以及同一質(zhì)粒在不同農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明菌絲在小米粒培養(yǎng)基上培養(yǎng)15~20天為最佳的農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化時(shí)間；不同的農(nóng)桿菌EHA105和LBA4404侵染菌絲后的轉(zhuǎn)化效率沒有