青蒿茉莉酸受體AaCOI1的功能研究.pdf

1、青蒿素（Artemisinin）是一種經(jīng)典的C15類型的倍半萜類化合物，因其結(jié)構(gòu)中特有過氧橋鍵結(jié)構(gòu)，使得其對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾的治療十分明顯；世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦青蒿素聯(lián)合療法作為治療瘧疾的首選。最新的研究發(fā)現(xiàn)青蒿素對于抵抗病毒，抗腫瘤活性，治療糖尿病和肺結(jié)核等疾病的治療也有顯著效果，其市場需求巨大。然而青蒿素的化學全合成因其合成產(chǎn)率低，副產(chǎn)物多，而且毒性較大，短時間內(nèi)還很難應用于實際的生產(chǎn)。利用發(fā)酵工程部分合成青蒿的前體，然后

2、再經(jīng)過體外氧化合成青蒿素的技術(shù)雖然已經(jīng)比較的成熟，但是其產(chǎn)量有限，相對于巨大的市場需求，任然存在巨大的市場差額。目前，從青蒿中分離提取青蒿素仍然是青蒿素市場供應的主要來源，但是野生型青蒿中提取青蒿素的含量極低，約占植株全部干重的0.01％-0.8%，于是，如何提高青蒿植株中青蒿素的累積，就成了當今研究植物次生代謝產(chǎn)物的主要目標。
　　茉莉酸酯類是茉莉酸（Jasmonic acid，JA）及茉莉酸衍生物的統(tǒng)稱，是重要的植物信號分子。

3、對于植物來說，其生長發(fā)育的過程、對環(huán)境改變的防御響應和它的次級代謝產(chǎn)物的合成和積累都與茉莉酸有著舉足輕重的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)外源噴灑茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）處理青蒿植株時可以使青蒿素的含量顯著累積上調(diào)。COI1作為茉莉酸途徑的唯一受體，主要和SCF形成SCF COI1復合物存在于植物體內(nèi)，對植物的生長、耐鹽性和抗逆性都起到了至關(guān)重要的作用。在番茄、水稻和橡膠等植物中對JA信號通路中的COI1受體相關(guān)功能已

4、有一定的研究，而在青蒿中JA信號通路對青蒿素的生物合成調(diào)控具有重要作用，但對于JA信號通路中的基本原件并不是很清楚，因此本研究從青蒿中克隆JA信號通路受體編碼基因AaCOI1并驗證其生物學功能，為揭示JA調(diào)控青蒿素生物合成的分子機制奠定重要基礎。
　　本文以NCBI登錄的擬南芥AtCOI1序列為基準，通過blast比對在青蒿轉(zhuǎn)錄組中查找到對應的COI1基因序列。通過PCR克隆后測序并對序列分析發(fā)現(xiàn)：AaCOI1的cDNA全長176

5、7 bp（GenBank登錄號：KY706201），它包含1752 bp的開放閱讀框(Coding Domain Sequence, CDS)，并編碼一個584個氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)屬于親水性蛋白，其富含亮氨酸重復序列（LRR）和F-box結(jié)構(gòu)域，但沒有跨膜區(qū)、復合螺旋區(qū)、信號肽等結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位結(jié)果顯示：AaCOI1特異性定位在細胞核中，雙分子熒光互補（BiFC）技術(shù)實驗結(jié)果顯示，AaCOI1與青蒿中的AaJAZ1和AaJAZ5存

6、在相互作用。從青蒿cDNA文庫中克隆得到AaJAZ5序列，cDNA全長為1044 bp（GenBank登錄號：KX034796），包括564 bp的CDS，且編碼188個氨基酸?；虮磉_譜結(jié)果顯示；AaCOI1、AaJAZ5在青蒿的根中的相對表達量較高，在葉、花和莖中表達量較低；同時發(fā)現(xiàn)，AaCOI1、AaJAZ5受到MeJA誘導性表達。MeJA處理后AaCOI1、AaJAZ5基因的表達量在3h時呈顯著提高（P＜0.05），這些結(jié)果進一

7、步證實了AaCOI1和AaJAZ5都是JA信號通路的組成元件。在擬南芥中過量表達AaCOI1基因，因純合突變的coi1-1是雄性不育，而coi1-1雜合型擬南芥是可育的，所以轉(zhuǎn)入雜合型coi1-1的擬南芥中，篩選并獲得純系的純合突變背景的轉(zhuǎn)基因擬南芥可發(fā)育成角果，并且在MeJA處理擬南芥后發(fā)現(xiàn)互補之后的擬南芥對甲基茉莉酸敏感，與純合突變的coi1-1相比根會變短和野生型擬南芥情況一樣，回復突變后的擬南芥在MeJA處理后花青素的含量以及花

8、青素合成途徑上相關(guān)基因表達量都在增加，這些結(jié)果都說明了AaCOI1可以互補于純合突變的擬南芥，進一步驗證了，在甲基茉莉酸途徑中AaCOI1的重要作用。綜上所述，本研究克隆了來源于青蒿編碼JA信號受體蛋白的COI1基因，采用qPCR研究了其在不同組織及誘導條件下的表達差異；通過亞細胞定位分析AaCOI1定位于細胞核中表達，并且能夠與JAZ5在核中出現(xiàn)物理結(jié)合，說明本研究克隆的AaCOI1參與了JA信號通路；為進一步研究AaCOI1的生物學