臭豆腐鹵水中多聚糖降解菌的篩選及其在微囊生物制劑中的應(yīng)用.pdf

1、臭豆腐鹵水中含有復(fù)雜的微生物菌群，同時(shí)鹵水中含有蔬菜、大豆原料以及部分動(dòng)物性原料降解形成的纖維素、木聚糖、殼聚糖、大豆低聚糖等多種多聚糖。但目前對(duì)臭豆腐鹵水中參與降解多糖的微生物種類(lèi)以及微生物之間的相互作用尚不清楚。本研究旨在應(yīng)用常規(guī)細(xì)菌分離及分子生物學(xué)方法分離臭豆腐鹵水中的多聚糖降解菌，為開(kāi)發(fā)利用新型微生物資源提供材料依據(jù)，主要結(jié)果如下:
　　(1)本研究首先用三種低聚糖（大豆低聚糖、低聚木糖和低聚果糖）作為碳源制備改良MRS培

2、養(yǎng)基，對(duì)臭豆腐鹵水樣品中微生物進(jìn)行厭氧培養(yǎng)富集，提取培養(yǎng)物中微生物總DNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析菌群構(gòu)成。結(jié)果顯示經(jīng)低聚糖培養(yǎng)基富集后，樣品中微生物多樣性降低。維恩圖結(jié)果顯示不同低聚糖組間具有共同和特有的OTU，其中原始樣品(chou)特有OTU數(shù)為1041個(gè)，顯著高于富集培養(yǎng)組，表明各低聚糖培養(yǎng)基對(duì)臭豆腐鹵水樣品中微生物具有一定的選擇性。在門(mén)水平上，變形菌門(mén)顯著減少，而厚壁菌門(mén)所占比例有較為顯著的提高并成為優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)。葡萄糖(mrs)富集組

3、中厚壁菌門(mén)所占比例最高為82.2％;在屬水平上，低聚糖富集組假單胞菌屬和弓形桿菌屬顯著減少，所占比例均不足1％，而富集后各組中鏈球菌屬和乳桿菌屬所占比例都顯著提高，大豆低聚糖富集組(dou)中提高至29.37％和3.71％;低聚木糖富集組(mu)中提高至17.98％和14.95％;低聚果糖富集組(guo)中則為24.12％和6.79％;但mrs組中鏈球菌屬和乳桿菌屬所占比例最高，為30.35％和24.91％，說(shuō)明相比較低聚糖富集組，葡萄

4、糖對(duì)豆腐鹵水中的鏈球菌屬和乳桿菌屬富集能力最強(qiáng)。相比較mrs富集組，三種低聚糖富集組中消化鏈球菌屬、普氏菌屬和梭菌屬都有顯著的增加。
　　(2)運(yùn)用傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法，對(duì)低聚糖固體平板上的菌落進(jìn)行分離純化和鑒定。結(jié)果顯示，在低聚木糖、低聚果糖、大豆低聚糖培養(yǎng)基中篩選出一株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum YZUF1)，在低聚木糖培養(yǎng)基中篩選出一株表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis

5、 YZUS2)。分離株在低聚木糖、低聚果糖、大豆低聚糖和MRS培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌YZUF1在大豆低聚糖和低聚木糖培養(yǎng)基中延滯期為4h，最大生長(zhǎng)速率為0.049和0.118，菌體最大生長(zhǎng)量為0.609和0.872;表皮葡萄球菌YZUS2在各培養(yǎng)基中延滯期均為4h，菌株在低聚果糖培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)和MRS培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)接近，最大生長(zhǎng)速率都為0.127，菌體最大生長(zhǎng)量為1.123和1.072。
　　以殼寡糖為碳源制備改良MRS瓊脂

6、培養(yǎng)基，并對(duì)臭豆腐鹵水中微生物進(jìn)行富集，結(jié)果獲得一株高降解殼寡糖菌株YZUc2-3。經(jīng)過(guò)16SrDNA測(cè)序鑒定，分離菌株YZUc2-3為棒狀桿菌(Corynebacterium vitaeruminis)，同源性為99.6％。
　　(3)應(yīng)用YZUc2-3菌株、殼寡糖以及YZUc2-3菌株+殼寡糖對(duì)ICR小鼠進(jìn)行灌胃飼養(yǎng)，分析YZUc2-3和殼寡糖對(duì)小鼠糞便菌群構(gòu)成的影響。發(fā)現(xiàn)經(jīng)108cfu/mLYZUc2-3和3％殼寡糖灌胃小鼠

7、后，小鼠糞便中乳酸桿菌屬較生理鹽水組(1.32％)均有所提高，分別為3.96％和13.4％，但YZUc2-3菌株+殼寡糖組中乳酸桿菌屬比例較生理鹽水組相比顯著降低，為0.57％;處理組與對(duì)照組小鼠糞便中鏈球菌屬所占比例無(wú)明顯差異均在2.5％左右。結(jié)果表明:菌株YZUc2-3和殼寡糖單獨(dú)處理均能提高腸道乳酸桿菌屬比例，混合飼喂時(shí)YZUc2-3能在腸道內(nèi)利用殼寡糖形成優(yōu)勢(shì)菌群。
　　(4)殼聚糖在體內(nèi)能夠有效保護(hù)生物活性材料免受降解，

8、但如何使生物活性物從殼聚糖中高效釋放出來(lái)目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本研究探討了獲得的殼聚糖降解菌YZUc2-3作為生物釋放劑的可能性。以海藻酸鈉為包埋材料，輔以水溶性殼聚糖，對(duì)噬菌體和菌株YZUc2-3進(jìn)行同時(shí)包埋，研究噬菌體微囊在菌株YZUc2-3的介導(dǎo)作用下體外釋放噬菌體的行為。結(jié)果表明制成的微囊結(jié)構(gòu)粒徑均一，形態(tài)規(guī)整，平均粒徑為630±37μm。模擬噬菌體微囊體外噬菌體釋放，結(jié)果隨時(shí)間延長(zhǎng)，各組微囊中噬菌體釋放量不斷提高，經(jīng)包埋菌株YZ