ROS清除性納米粒的構(gòu)建及其對藥物引起的組織損傷的防治作用研究.pdf

1、目的：
　　本課題擬通過構(gòu)建具有過氧化氫(H2O2)清除能力的載體材料，裝載具有自由基清除功能的4-羥基TEMPO(Tpl)，自組裝形成納米粒。該納米粒具有ROS響應(yīng)性，可靶向到氧化應(yīng)激水平升高的組織損傷部位，并在ROS的作用下，水解釋放出Tpl，達(dá)到對藥物引起的組織損傷的靶向治療作用。
　　方法：
　　1.H2O2清除性載體材料的合成與表征
　　將9.44mmol的N，N-羰基二咪唑(CDI)與4.72mmol

2、的4-羥甲基苯硼酸頻哪醇酯(PBAP)溶于無水二氯甲烷(DCM)中，25℃攪拌1h，用去離子水和飽和NaCl溶液各洗3次，再用Na2SO4干燥30min。過濾、干燥濾液，得到CDI活化的PBAP(CDI-PBAP)。
　　將1.52g的CDI-PBAP溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，再加入250mg的β-環(huán)糊精(β-CD)和0.8g的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，25℃磁力攪拌過夜，加入去離子水沉淀，離心，去離子水清洗沉淀3次，-

3、80℃凍干沉淀，即得到具有H2O2清除性的β-CD材料(Ox-bCD)。用傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier Transform Infrared Spectrometer，F(xiàn)TIR Spectrometer)和核磁共振波譜儀對Ox-bCD進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。
　　2.空白納米粒的制備
　　卵磷脂和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(DSPE-PEG2000)溶于無水乙醇并分散在水中，65℃攪拌1h。將溶于無水甲醇中的Ox-bCD

4、滴加到上述溶液中，室溫?cái)嚢?h，10000rpm離心10min，得到空白納米粒(NPs)。測定其粒徑大小及表面電位，利用透射電鏡(TEM)對納米粒的形貌進(jìn)行表征。
　　3.空白納米粒水解性能的評價(jià)
　　將5mg的NPs分別加入到磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和不同濃度的H2O2溶液中，通過紫外可見分光光度計(jì)測其透光率。
　　4.ROS清除性載藥納米粒的制備
　　卵磷脂和DSPE-PEG2000溶于無水乙醇中，65℃攪拌

5、1h。將溶于無水甲醇中的Ox-bCD和Tpl滴加到上述溶液中，室溫?cái)嚢?h，10000rpm離心10min，得到載藥納米粒(Tpl-NPs)。測定其粒徑大小及表面電位，利用TEM對納米粒的形貌進(jìn)行表征，高效液相(HPLC)測其載藥量。
　　5.ROS清除性納米粒的體外釋放評價(jià)
　　配制pH1.2的PBS溶液及pH7.4的PBS溶液分別模擬胃腸道的酸堿環(huán)境，將載藥納米粒Tpl-NPs置于此模擬環(huán)境中，于特定時(shí)間取釋放液。通過H

6、PLC測Tpl的釋放量。
　　6.體外ROS清除性能測定
　　配制30mM的H2O2溶液，并用此溶液配制0.064、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的Tpl-NPs（或Ox-bCD）溶液，37℃孵育48h后測定溶液中剩余的H2O2的量，并繪制清除H2O2曲線。同時(shí)，配制0.064、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的Tpl-NPs（或Ox-bCD）溶液，按照抗超氧陰離

7、子自由基試劑盒說明書進(jìn)行檢測，并繪制抗超氧陰離子活力單位曲線。
　　7.口服ROS清除性納米粒在NSAIDs引起的胃腸損傷小鼠體內(nèi)的分布研究
　　卵磷脂和DSPE-PEG2000溶于無水乙醇中，65℃攪拌1h。將溶于無水甲醇中的Ox-bCD和花青素染料7.5(Cy7.5)滴加到上述溶液中，室溫?cái)嚢?h后，10000rpm離心10min，得到裝載Cy7.5的納米粒（Cy7.5-NPs），測定其粒徑大小及表面電位，利用透射電鏡(

8、TEM)對納米粒的形貌進(jìn)行表征?？诜﨏y7.5-NPs后，于不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠并解剖小鼠取胃、空腸、回腸、結(jié)直腸，用活體成像系統(tǒng)觀察并統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度。
　　8.口服ROS清除性納米粒治療NSAIDs引起的胃腸損傷的藥效學(xué)評價(jià)
　　雄性Balb/c小鼠禁食12h后，通過口服吲哚美辛(IND)建立NSAIDs介導(dǎo)的胃腸損傷模型，在口服吲哚美辛前1h口服生理鹽水、Tpl、NPs、Tpl-NPs、鋁碳酸鎂。12h后取胃、空腸、回腸做蘇

9、木精-伊紅(H&E)染色切片，胃、空腸、回腸的組織勻漿液測定過氧化氫酶(CAT)、過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)、IL-1β、IL-10、TNF-α的含量。
　　9.口服ROS清除性納米粒對NSAIDs引起的胃腸損傷的生存率評價(jià)
　　雄性Balb/c小鼠口服生理鹽水、Tpl、NPs、Tpl-NPs、鋁碳酸鎂，1h后口服吲哚美辛。以此方式連續(xù)給藥10天，每天觀察其生存狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)其死亡個數(shù)。

10、>　　10.靜脈注射ROS清除性納米粒對APAP引起的肝損傷的初步藥效學(xué)評價(jià)
　　雄性C57小鼠禁食15-18h，通過腹腔注射對乙酰氨基酚（APAP）建立急性肝損傷模型，并給與正常飼養(yǎng)，6h后尾靜脈注射生理鹽水、Tpl-NPs，12h后取肝臟做H&E染色切片，肝臟的組織勻漿液測定H2O2、MDA、MPO、IL-1β、IL-10和TNF-α的含量。
　　11.ROS清除性納米粒在細(xì)胞水平的初步安全性評價(jià)
　　將巨噬細(xì)胞（

11、RAW264.7）種植于孔板，與含血清培養(yǎng)基配制的納米粒溶液共孵育12或24h后，MTT法測定細(xì)胞存活率。
　　12.ROS清除性納米粒的體外溶血實(shí)驗(yàn)
　　提取雄性大鼠的紅細(xì)胞，與不同濃度Tpl-NPs渦旋混合后，室溫放置2h，離心取上清，加到96孔板進(jìn)行血紅蛋白的含量測定。
　　13.口服ROS清除性納米粒的初步安全性評價(jià)
　　通過一次性口服2.5g/kg、5.0g/kg的Tpl-NPs，每兩天記錄一次體重，兩

12、周后取全血測血常規(guī)，取血清測腎功能、肝功能，取各臟器及胃、十二指腸、空腸、回腸做H&E染色切片，并統(tǒng)計(jì)臟器指數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.通過設(shè)計(jì)得到了具有H2O2清除性能的載體材料，核磁共振結(jié)果顯示β-CD上含有5個PBAP單元。
　　2.基于納米沉淀法，成功的得到了空白納米粒和載藥納米粒，粒徑分別為136.9和146.1nm，表面電位分別為為-30.9和-24.7mV，其中Tpl-NPs中Tpl的載藥量約為15％。

13、r>　　3.ROS清除性納米粒在PBS溶液中幾乎不水解，在不同濃度的H2O2溶液下水解率不同，且隨著H2O2濃度增大，水解率增大。在模擬胃腸道pH條件下，ROS清除性納米粒在pH1.2的酸性介質(zhì)中藥物釋放緩慢，而在pH7.4和H2O2共同存在的條件下釋放較為迅速。
　　4.ROS清除性能實(shí)驗(yàn)表明，Tpl-NPs(Ox-bCD)清除H2O2呈線性關(guān)系，抗超氧陰離子活力單位呈曲線，在一定范圍內(nèi)呈線性。
　　5.活體成像結(jié)果顯示，

14、口服Cy7.5-NPs后，Cy7.5在胃腸損傷模型組中比正常小鼠組中聚集的時(shí)間更長，熒光強(qiáng)度也更強(qiáng)。
　　6.基于胃腸損傷模型的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口服Tpl-NPs后，胃、空腸、回腸部位的氧化應(yīng)激水平降低，生存率提高，通過H&E染色組織切片結(jié)果看到組織損傷減小。
　　7.在肝損傷模型中，靜脈注射Tpl-NPs對APAP引起的肝臟損傷起到了治療與保護(hù)作用。
　　8.初步安全性結(jié)果顯示，Tpl-NPs對RAW264.7巨

15、噬細(xì)胞無明顯毒性;同時(shí)對紅細(xì)胞無溶血現(xiàn)象。口服高劑量ROS清除性納米粒未見血常規(guī)、腎功能和肝功能的改變;H&E染色組織切片未見臟器及胃、十二指腸、空腸、回腸部位病理性變化。
　　結(jié)論：
　　1.通過將PBAP共價(jià)鍵合于β-CD上，得到了具有ROS響應(yīng)性和H2O2清除能力的β-環(huán)糊精載體材料，即Ox-bCD。
　　2.用改良的納米沉淀/自組裝法成功制備了空白納米粒和負(fù)載自由基清除劑Tpl的納米粒，其形態(tài)良好，粒徑分布均一

16、，其具有ROS響應(yīng)性;且體外實(shí)驗(yàn)證明Tpl-NPs能有效清除H2O2和超氧陰離子。
　　3.口服或靜脈給藥后，Tpl-NPs能夠靶向于氧化應(yīng)激水平增高的組織損傷部位，靶向至損傷部位后，緩慢釋放Tpl，延長其在損傷部位的保留時(shí)間。通過消耗局部組織中的H2O2，并利用釋放的Tpl清除自由基，起到對胃腸損傷及肝臟損傷的保護(hù)與治療且副作用較低。
　　4.ROS清除性納米粒對細(xì)胞的毒性較小，一次大劑量口服后對血常規(guī)、肝功能和腎功能無影