PLFA對清香大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析及產(chǎn)酯酵母的篩選應(yīng)用研究.pdf

1、清香型白酒生產(chǎn)用曲有三種，即清茬曲、紅心曲和后火曲，生產(chǎn)中采用分別制曲，混合使用的工藝。大曲生產(chǎn)工藝特點為生料制曲、自然接種和固態(tài)發(fā)酵，導(dǎo)致曲塊之間均一性較差，不同季節(jié)或批次之間有波動。大曲是釀酒的糖化發(fā)酵劑，其中微生物數(shù)量是評價大曲質(zhì)量的重要指標(biāo)。目前微生物數(shù)量測定方法仍為平板菌落計數(shù)法，耗時且不準(zhǔn)確。迫切需要快速準(zhǔn)確定量方法分析大曲微生物數(shù)量。
　　酵母菌是釀酒過程中的主要微生物類群，尤其在清香白酒生產(chǎn)中，既關(guān)系到酒的產(chǎn)量，也

2、關(guān)系到酒的質(zhì)量。清香主體香氣成分乙酸乙酯主要由酵母菌產(chǎn)生。對清香白酒生產(chǎn)中涉及到的酵母菌類群及產(chǎn)酯酵母的研究非常重要。
　　本論文嘗試用磷脂脂肪酸(PLFA)圖譜方法分析大曲中微生物類群。從大曲及酒醅中分離酵母菌，進行鑒定及多樣性及聚類分析，篩選產(chǎn)酯較高的酵母菌，優(yōu)化培養(yǎng)條件的相關(guān)研究，主要結(jié)果如下：
　　1）使用PLFA指紋圖譜的方法研究三種清香型大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)。三種大曲各自顯示了不同的指紋圖譜特征。PLFA18:3

3、 w6c(3,6,9)作為常用的真菌標(biāo)記，在后火曲中最多，紅心曲中最少，在這兩種樣品中分布較為穩(wěn)定，而在清茬曲中呈現(xiàn)一定波動。PLFA18:1 w9c另外常用的一個真菌標(biāo)記，僅僅在紅心曲中檢測到，并且具有穩(wěn)定的含量。紅心曲中真菌與細(xì)菌的比例為11.2，這個數(shù)值明顯高于清茬和后火曲，分析其原因可能是因為紅心曲在制曲過程中形成了紅心，其中含有較多真菌類微生物。主成分分析發(fā)現(xiàn)，指紋圖譜的變異是由于大曲類型的不同引起的。方差分析顯示，某些特定的

4、脂肪酸在三種大曲中含量有顯著性的差異，可作為潛在的生物標(biāo)志表征不同類型大曲。
　　2）從清香大曲及酒醅中分離到48株釀酒相關(guān)酵母。通過WL培養(yǎng)基培養(yǎng)后主要展示出5種不同的菌落特征，結(jié)合磷脂脂肪酸（PLFAs）圖譜和26SrDNA D1/D2區(qū)序列，得到Saccharomyces cerevisiae、Issatchenkia orientalis（Candida krusei/Pichia kudriavzevii）、Crypto

5、coccus uzbekistanensis、Rhodotorula mucilaginosa、Wickerhamomyces anomalus5個類群。進一步分析其PLFAs發(fā)現(xiàn)，16:1 Cis9(w7)和18:2 CIS9,12/18:0a可以作為特征磷脂脂肪酸區(qū)分釀酒酵母與非釀酒酵母。PLFA得到的純酵母菌的指紋圖譜有利于對大曲及酒醅中酵母菌分析提供理論依據(jù)。
　　3）將分離得到的48株酵母全部進行發(fā)酵力及產(chǎn)酯量的測定。綜

6、合多種指標(biāo)篩選出產(chǎn)酯高的優(yōu)良菌株Wickerhamomyces anomalus酵母菌J2-5。經(jīng)產(chǎn)酯條件優(yōu)化，選用高粱糖化液體發(fā)酵培養(yǎng)基。最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度20℃，培養(yǎng)基pH值為4，糖度為白利度7度。隨著發(fā)酵過程的進行，總酯有增加的趨勢。在高粱液體糖化液中發(fā)酵20天產(chǎn)酯量可達7.63g/L。比初始條件產(chǎn)酯量提高了3倍多。固體發(fā)酵酒醅與酯化液進行串蒸，酒樣總酯量與對照相比提高了3-4倍。麩曲實驗證明，J2-5酵母菌在麩皮中生長良好，