CS-PAA-SN-38@FA-cmCHI-PLGA納米顆粒的制備和體外生物效應研究.pdf

1、背景：
　　癌為人類最常見三大疾病之一，成為人類死亡第二號殺手，死亡率居高不下。在目前癌癥的臨床治療中，化學抗癌藥物仍然發(fā)揮著極為重要的作用，但是這些化療藥物依然存在一些難以克服的毒副作用，阻礙了其的應用。目前，為克服小分子化藥副作用，納米遞藥系統(tǒng)炙手可熱。但是，目前遞藥系統(tǒng)一般只能遞送藥物到血液或者細胞質中，接下來藥物何去何從，便不得而知。但是許多抗癌藥物只有在進入細胞核后，才能發(fā)揮作用，因此需要載體精準遞送到靶位置。再者，抗癌

2、藥物自身破壞腫瘤細胞的同時也會對正常細胞有一定程度的損傷。
　　智能的遞送藥物分子至病灶部位，減少用藥，使得副作用降低以及減少病人痛苦。靶向遞藥系統(tǒng)(targeted drug delivery system，TDDs)，使得攜帶物具備集中定位于特定位置，繼而減少毒副作用的效應。進而，兼?zhèn)涠ㄎ恍罘e、微量高效等效用。研究發(fā)現(xiàn)，葉酸受體為某些腫瘤細胞過表達分子，并且葉酸分子為人體正常所需物質。
　　目的：
　　本實驗從細胞

3、本身生活環(huán)境，細胞核質內(nèi)外特異性差別為依據(jù)，利用納米系統(tǒng)提高化學藥物的利用，另外由癌細胞特異表達葉酸受體為出發(fā)點，偶聯(lián)葉酸分子，使得納米系統(tǒng)于循環(huán)過程中具有靶向性。本課題組已經(jīng)成功制備粒徑較小CS/PAA顆粒，并順利包載入外層cmCHI/PLGA形成雙層納米顆粒。由于之前工作所制備納米顆粒具有被動靶向性，主動尋靶能力不強。因此在此基礎上，課題設計將納米顆粒具有主動靶向的功能。制備大包小的雙層粒，并在外層顆粒材料之一cmCHI上偶聯(lián)葉酸分

4、子，使之具有靶向功能。并且，內(nèi)層載藥利用物理吸附的方法包載難溶于水的SN-38。整個納米系統(tǒng)具有逐級釋放，精準遞送之功能。先是外層顆粒于酸性胞質環(huán)境釋放，而后小顆粒入核于核內(nèi)中性環(huán)境下釋放SN-38，智能遞送藥物至作用部位。
　　方法：
　　制備表征:內(nèi)層顆粒制備采用點滴法，控制滴速等條件均勻化粒徑，物理吸附方式載藥SN-38。通過透射、掃描、粒徑分析表明內(nèi)層小顆粒20nm左右，為均勻光滑球體結構。離子聯(lián)法合成葉酸連接至羧甲

5、基殼聚糖上，XRD表明葉酸與cmCHI以離子鍵結合。依據(jù)復乳化原理合成雙層顆粒，經(jīng)一系列表征證明之，并檢測其包封載藥特征。
　　生物效應:采用WST-1試劑盒檢測游離原藥、內(nèi)外層顆粒以及偶聯(lián)葉酸分子雙層顆粒的細胞毒及材料安全性。AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡，佐證材料安全性。
　　細胞攝取:熒光復染標記示蹤內(nèi)外雙層顆粒位置及去路問題，根據(jù)顏色疊加原理于激光共聚焦顯微鏡下觀測整個系統(tǒng)遷移情況。
　　結

6、果:
　　內(nèi)層顆粒約為20nm左右，為統(tǒng)一的光滑球型。雙層顆粒為170nm左右，均一的球型，葉酸以離子鍵結合其上。核殼納米顆粒包封達到86.91％，載藥為1.32％。透射電鏡及熒光鏡檢佐證小顆粒已經(jīng)包入大顆粒中。外層顆粒由于PLGA的酸性響應能力，可在胞質中的偏酸性環(huán)境下破裂釋放小顆粒。內(nèi)層顆粒中性環(huán)境及堿性條件下聚丙烯酸發(fā)生溶漲反應，SN-38通過解吸附作用釋放。整個納米系統(tǒng)具有敏銳的pH敏感性，且葉酸分子的加入，可以引導納米體

7、系至癌細胞周圍。
　　WST-1顯示納米體系所選材料無毒性作用，AnnexinⅤ-FITC/PI檢測結果顯示材料引起的死亡，為溫和的凋亡方式。細胞毒結果顯示，核殼結構納米系統(tǒng)兩株細胞A549/Hela存活力最低，高于游離藥組，且對于Hela細胞，偶聯(lián)葉酸后細胞毒性作用更顯著。
　　共聚焦顯微鏡鏡檢顯示，設計納米體系先是外層破裂釋放CS/PAA/SN-38顆粒，繼而，小顆粒擴散入核。入核后，伴隨溶脹反應，SN-38解吸附游離于