檢驗(yàn)前過(guò)程的步驟對(duì)靜脈全血細(xì)胞rna譜的影響、血液貯存溫度對(duì)血細(xì)胞rna譜的影響

1、GB/T XXXXX—XXXX/ISO 20186-1:2019 10 A A 附 錄 A （資料性） 檢驗(yàn)前過(guò)程的步驟對(duì)靜脈全血細(xì)胞 RNA 譜的影響 A.1 附錄 A 和附錄 B 中實(shí)驗(yàn)操作的一般資料 體外診斷通用分析前工具和程序的標(biāo)準(zhǔn)化與改進(jìn)（SPIDIA1）是歐洲委員會(huì)資助的一個(gè)為期四年半的項(xiàng)目，旨在對(duì)體外診斷中的檢驗(yàn)前程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和改進(jìn) [30]。 SPIDIA聯(lián)盟，為了識(shí)別和改進(jìn)影響靜脈全血細(xì)胞RNA譜檢驗(yàn)的關(guān)鍵檢驗(yàn)前

2、步驟，進(jìn)行了兩個(gè)連續(xù)的泛歐洲比對(duì)實(shí)驗(yàn)[13][24]。 總共有93個(gè)和109個(gè)歐洲實(shí)驗(yàn)室分別參加了比對(duì)試驗(yàn)1和比對(duì)試驗(yàn)2。 比對(duì)試驗(yàn)2的方案包括由SPIDIA聯(lián)盟做出的改進(jìn)。兩份來(lái)自單個(gè)供者的血液能力驗(yàn)證標(biāo)本，都帶有血細(xì)胞RNA譜穩(wěn)定劑（PAXgene2）血液RNA管）或不帶血液細(xì)胞RNA譜穩(wěn)定劑（K2EDTA管），由中心SPIDIA實(shí)驗(yàn)室制備，隨后運(yùn)送到參與的實(shí)驗(yàn)室。此標(biāo)本用專用的箱子運(yùn)送，以保持2℃到8℃的恒溫范圍。 參與者被要求在

3、接收后（采血后24小時(shí)內(nèi)）立即從一管中提取細(xì)胞RNA，在環(huán)境溫度或冷藏溫度下貯存24小時(shí) （采血后48小時(shí)內(nèi)）后從第二管中提取。 參與者被要求使用他們常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室程序來(lái)分離細(xì)胞RNA，并在干冰上將純化的RNA樣品送回SPIDIA實(shí)驗(yàn)室。在SPIDIA實(shí)驗(yàn)室，對(duì)RNA樣品的純度、產(chǎn)量、完整性和干擾物質(zhì)的存在進(jìn)行了評(píng)估。為了分析檢驗(yàn)前變量對(duì)血細(xì)胞RNA譜的影響，通過(guò)確認(rèn)過(guò)的標(biāo)記物檢測(cè)來(lái)確定RNA樣品中選定的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量[14]。這些包括用R

4、T-qPCR檢測(cè)FBJ小鼠骨肉瘤病毒致癌基因同源物（FOS）、白介素8（IL8）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、FBJ小鼠骨肉瘤病毒致癌基因同源物B（FOSB）和腫瘤壞死因子受體超家族，成員10c，無(wú)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的誘變物（TNFRSF10C）。 下面的結(jié)果展示了重要的發(fā)現(xiàn)。 A.2 采血管類型（有/無(wú)血液細(xì)胞 RNA 譜穩(wěn)定劑）對(duì)特定的血細(xì)胞 RNA 譜分析的影響 A.2.1 不穩(wěn)定的血細(xì)胞RNA譜 圖A.1顯示了檢驗(yàn)前過(guò)程血

5、液中4種基因的不穩(wěn)定表達(dá)。 標(biāo)本收集于不含血細(xì)胞RNA譜穩(wěn)定劑 （K2EDTA管,EDTA,n=78） 或含血細(xì)胞RNA譜穩(wěn)定劑 （PAXgene血液RNA管,PAX,n=28） 的采血管中。標(biāo)本在2℃～8℃下被運(yùn)送到參與的實(shí)驗(yàn)室， 并在采血后24小時(shí)內(nèi)分離細(xì)胞RNA[13]。 GB/T XXXXX—XXXX/ISO 20186-1:2019 12 Cq是量化的循環(huán)數(shù)[22]。 注3：c)中IL8 mRNA的定量通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行絕對(duì)

6、定量。 注4：通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 圖A.1 通過(guò) RT-qPCR 檢測(cè)用含血細(xì)胞 RNA 譜穩(wěn)定劑（PAX）或不含血細(xì)胞 RNA 譜穩(wěn)定劑（EDTA）的采血管采集的血液中 4 個(gè)基因的表達(dá) 在用含或者不含血細(xì)胞RNA譜穩(wěn)定劑的采血管收集的血液中，檢測(cè)到的體外基因表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（所有檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本的p值<0.001）。 結(jié)果表明，在2℃~8℃時(shí)，血細(xì)胞RNA圖譜仍可能發(fā)生變化。采血管中的血細(xì)胞R

7、NA譜穩(wěn)定劑，是避免或減少檢驗(yàn)前過(guò)程中血細(xì)胞RNA譜變化并使其接近于T0時(shí)的自然狀態(tài)的一個(gè)重要因素。 A.2.2 穩(wěn)定的血細(xì)胞RNA譜 圖A.2顯示了由有/無(wú)血細(xì)胞RNA譜穩(wěn)定劑的采血管采集的血液中的GAPDH基因體外的穩(wěn)定表達(dá)。 標(biāo)本收集于不含血細(xì)胞RNA譜穩(wěn)定劑 （K2EDTA管,EDTA,n=78） 或含血細(xì)胞RNA譜穩(wěn)定劑 （PAXgene血液RNA管,PAX, n=28）的采血管中。標(biāo)本在2℃~8℃下運(yùn)送到參與的實(shí)驗(yàn)室，并在

8、采血后24小時(shí)內(nèi)分離細(xì)胞RNA[13]。 標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明： X——采血管類型：EDTA,PAX Y——樣品值 = log10 (拷貝數(shù)/微克分離RNA) 注1：方框顯示的是上四分位數(shù)和下四分位數(shù) （25分位到75分位） 。 上面和下面的須狀線顯示了單個(gè)值的最大值和最小值，框內(nèi)的線顯示了每個(gè)數(shù)據(jù)集的中位數(shù)值。每個(gè)方框內(nèi)的點(diǎn)代表0時(shí)的測(cè)量值（T0，采血后立即分離RNA）[13]。 注2：GAPDH mRNA的定量通過(guò)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行絕對(duì)定量。