RGD共價結(jié)合氧化石墨烯生物活性界面的構(gòu)建及其生物性能研究.pdf

1、氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）是石墨烯（Graphene, GN）的氧化衍生物，因具有豐富的含氧功能團而易于表面功能化修飾，功能化的氧化石墨烯在生物傳感器的制造和骨組織工程的應(yīng)用正在擴大。然而，當(dāng)前報道對氧化石墨烯的RGD肽功能化修飾需要引入第三種鏈接分子，不但增加了實驗體系的復(fù)雜性，而且有可能改變氧化石墨烯自身的物理化學(xué)性能。因此，提供一種更為直接、簡單的方法實現(xiàn)氧化石墨烯表面生物功能化，并研究其生物性能顯得很有必

2、要。
　　RGD肽也被稱為細(xì)胞粘附肽，能夠促進細(xì)胞粘附、增殖和分化。RGD肽與GO的結(jié)合能否增強細(xì)胞的活性、能否作為細(xì)胞生物傳感器界面應(yīng)用于體外細(xì)胞學(xué)分析、能否應(yīng)用于骨組織工程，值得我們?nèi)パ芯刻剿鳌?br>　　目的：1、通過EDC/NHS耦合反應(yīng)將RGD肽共價修飾GO，合成一種新型的RGD-GO生物膜，并對其進行表征；通過RGD-GO生物膜修飾ITO電極作為傳感電極，研究其在電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用；2、研究RGD-GO生物膜促進C

3、3H10T1/2干細(xì)胞體外成骨分化的能力；3、考察RGD-GO生物膜體內(nèi)生物相容性；4、研究RGD-GO生物膜復(fù)合C3H10T1/2干細(xì)胞裸鼠皮下異位成骨的能力，將其在骨組織工程中的應(yīng)用進行初步的探索。
　　方法：1、將GO水溶液通過自然干燥形成GO薄膜，通過EDC/NHS耦合反應(yīng)，將具有胺功能團的RGD肽固定在GO膜表面，形成RGD-GO生物膜。原子力顯微鏡對修飾前后 GO表面進行形貌學(xué)表征，傅里葉變換紅外光譜測量修飾前后 GO

4、化學(xué)成分變化，接觸角測量儀對合成材料的親疏水性進行測量。同時，RGD-GO生物膜表面電化學(xué)性質(zhì)通過電化學(xué)阻抗譜（EIS）進行表征。2、分別在RGD-GO生物膜/GO膜上培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLFS)，CCK8檢測比較細(xì)胞活力，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架情況，通過image J軟件（NIH）分析細(xì)胞在兩種材料表面的粘附差異；將RGD-GO生物膜修飾在ITO電極表面，顯微鏡下觀察培養(yǎng)在 RGD-GO生物膜修飾的 ITO電極表面H

5、PDLFS的生長情況，通過電化學(xué)阻抗譜技術(shù)（EIS）檢測和對比分析HPDLFS細(xì)胞在RGD-GO生物膜/GO膜修飾電極表面的增殖粘附行為，通過EIS檢測脂多糖對HPDLFs細(xì)胞活力的影響，并以CCK-8實驗做為對照。3、以C3H10T1/2為干細(xì)胞模型，在RGD-GO生物膜表面培養(yǎng)不同時間后，通過顯微鏡觀察材料表面細(xì)胞的生長形態(tài)、激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架情況；通過檢測堿性磷酸酶活性、堿性磷酸酶染色實驗、茜素紅染色實驗、熒光定量PC

6、R檢測成骨相關(guān)基因OPN、OCN、Runx2的表達，考察在RGD-GO生物膜上培養(yǎng)的C3H10T1/2干細(xì)胞在未加成骨誘導(dǎo)因子的情況下成骨分化的能力；4、以臨床常用植骨材料Bio-Oss為對照、將RGD-GO生物膜同期植入SD大鼠背部皮下，通過大體觀察和形態(tài)組織分析，對比研究RGD-GO生物膜的體內(nèi)生物相容性；5、RGD-GO生物膜復(fù)合 C3H10T1/2干細(xì)胞植入裸鼠背部皮下，以臨床常用植骨材料Bio-Oss為對照，通過大體觀察、HE

7、染色、Masson染色、免疫組化染色，考察其異位成骨能力。
　　結(jié)果：1、與GO膜相比，RGD-GO生物膜線粗糙度和面粗糙度增加，親水性提高，F(xiàn)T-IR檢測發(fā)現(xiàn)，RGD-GO生物膜1732 cm-1的羧基（C-OH）吸收峰減弱，增加了1533 cm-1和1290 cm-1兩處吸收峰，而該兩個波數(shù)吸收峰分別對應(yīng)RGD肽的酰胺I和酰胺II的特征峰；電化學(xué)性質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)：RGD肽共價修飾在GO表面后，Rct值從2.1E4Ω增加至4.7E4

8、Ω, CPE-T值進一步增加至5.3E-6C。2、HPDLFS在兩種膜表面的細(xì)胞活力都隨著培養(yǎng)時間延長逐漸增加，但在RGD-GO生物膜上呈現(xiàn)更高的增殖能力（P＜0.05）。激光共聚焦顯微鏡下顯示：RGD-GO生物膜表面細(xì)胞密度值顯著高于 GO膜表面細(xì)胞密度值，RGD-GO生物膜表面細(xì)胞鋪展面積顯著高于GO膜表面的細(xì)胞平均面積（P＜0.05）。顯微鏡下顯示HPDLFs能夠培養(yǎng)在RGD-GO生物膜修飾的ITO電極表面；其粘附增殖的電化學(xué)阻抗

9、分析測量顯示：隨著HPDLFS在RGD-GO生物膜修飾的ITO電極表面的粘附和增殖，Ccell在2h~24h迅速降低，細(xì)胞鋪展形成細(xì)胞單層時，Ccell穩(wěn)定在8.2~8.5nF（72h），略高于HPDLFS在GO修飾的ITO電極表面的7.6~8.1nF；HPDLFS在RGD-GO生物膜修飾的ITO電極表面增殖中的Rcell值持續(xù)增大，形成細(xì)胞單層(72h)時Rcell值達到最大，約為1382Ω，在HPDLFS增殖過程中（24h及48h）

10、，細(xì)胞在RGD-GO生物膜修飾ITO電極表面的Rcell值高于細(xì)胞在GO修飾ITO電極表面的Rcell值；HPDLFS細(xì)胞在RGD-GO生物膜修飾ITO電極表面增殖過程中 R′S持續(xù)增大，在接種72h后達到最大值（～338Ω），且增殖過程中R′S值均高于HPDLFS細(xì)胞在GO修飾ITO電極表面增殖過程中的R′S值。這些結(jié)果與細(xì)胞計數(shù)結(jié)果相吻合。以RGD-GO生物膜為電化學(xué)阻抗譜檢測界面的細(xì)胞生物傳感器來研究 LP S對HPDLFS細(xì)胞增

11、殖的影響，電化學(xué)阻抗譜檢測結(jié)果與CCK-8測定的結(jié)果相似。3、C3H10T1/2細(xì)胞接種在 RGD-GO生物膜表面后，顯微鏡和激光共聚焦均顯示：RGD-GO生物膜能夠支持細(xì)胞粘附伸展并促進細(xì)胞粘附增殖。與 GO相比，RGD-GO生物膜表面細(xì)胞分別在培養(yǎng)3天、5天、7天、9天時堿性磷酸酶活性持續(xù)增高（P＜0.05），培養(yǎng)9天后堿性磷酸酶染色呈現(xiàn)陽性，培養(yǎng)14天后茜素紅染色陽性；在培養(yǎng)9天后成骨相關(guān)基因OPN、OCN、Runx2的表達水平顯

12、著高于GO組和對照組（P＜0.05）。4、RGD-GO生物膜植入 SD大鼠皮下2周、4周、8周、12周后，與Bio-Oss骨支架材料一樣均未見炎癥細(xì)胞和異物巨噬細(xì)胞，而且植入材料與組織界限逐漸清晰，由最初的薄層纖維樣物到形成纖維膜樣物、周圍纖維組織逐漸增厚，植入皮下材料范圍逐漸減小。5、裸鼠皮下植入8周后HE染色、Masson染色結(jié)果顯示復(fù)合了干細(xì)胞的Bio-Oss/ RGD-GO均為陽性，免疫組化分析可見成骨的基質(zhì)或骨樣組織。

13、　　結(jié)論：1、本實驗成功的合成了RGD-GO生物膜，所獲得的RGD-GO生物膜具有好的穩(wěn)定性和特殊的電化學(xué)特征，能夠作為新型的細(xì)胞傳感器界面實現(xiàn)細(xì)胞體外電化學(xué)檢測分析。2、RGD-GO生物膜具有良好的體外生物相容性，具有增強細(xì)胞粘附增殖、誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的能力，在未加成骨誘導(dǎo)液的前提下可以實現(xiàn)C3H10T1/2干細(xì)胞的成骨分化。3、RGD-GO生物膜具有良好的體內(nèi)生物相容性；體內(nèi)異位成骨實驗表明復(fù)合了C3H10T1/2干細(xì)胞的RGD-