基于羅丹明衍生物熒光探針的設(shè)計、合成及應(yīng)用研究.pdf

1、次氯酸(HOCl)是生物體內(nèi)重要的活性氧之一，是在髓過氧化物酶(MPO)的催化下由H2O2和Cl-反應(yīng)而生成的。它在眾多生理活動中發(fā)揮著重要作用，是生物抵御細(xì)菌入侵的天然屏障。生物體內(nèi)HOCl不受控制的產(chǎn)生可能與某些疾病密切相關(guān)?？墒堑侥壳盀橹?，由于受檢測手段的限制，次氯酸在這些疾病中扮演的具體角色尚不清楚。因此，為了清楚地了解HOCl在生理活動中的作用，預(yù)防和治療各種疾病，發(fā)展高靈敏度的、即時性的HOCl檢測方法顯得尤為重要，也是世界

2、科學(xué)家們所面臨的一種挑戰(zhàn)。熒光探針技術(shù)因其選擇性好、靈敏度高、操作簡單、響應(yīng)快、組織損傷小等諸多優(yōu)點，無疑是解決這一難題的有效手段。因此基于熒光探針技術(shù)來檢測生物體內(nèi)HOCl的方法迅速發(fā)展，有關(guān)次氯酸熒光探針的文獻(xiàn)報道迅速增多。
　　在這些次氯酸探針中多數(shù)是基于單熒光發(fā)射的探針，它們易受環(huán)境、探針濃度以及激發(fā)光強度變化的影響，而導(dǎo)致測量的準(zhǔn)確度下降;尤其是較小的斯托克斯位移嚴(yán)重影響著細(xì)胞的成像分辨率。然而，熒光比率探針擁有雙熒光發(fā)

3、射，增加了自身修正功能，能夠很好地消除來自環(huán)境、探針濃度及激發(fā)光強度變化的干擾;更重要的是熒光比率探針擁有較大的偽-斯托克斯位移，這將大大提高細(xì)胞的成像分辨率，因此熒光比率探針無疑是解決上述問題的上佳選擇。
　　羅丹明類熒光團(tuán)具有諸多優(yōu)異的光化學(xué)性質(zhì)，如較大的摩爾消光系數(shù)、較高的量子產(chǎn)率、可見光區(qū)域內(nèi)的吸收和發(fā)射以及優(yōu)良的光穩(wěn)定性，所以在各類探針的設(shè)計中被廣泛應(yīng)用。其設(shè)計原理主要是通過螺環(huán)控制氧雜蒽的共軛體系來調(diào)節(jié)熒光發(fā)射。當(dāng)探針

4、螺環(huán)關(guān)閉時，氧雜蒽結(jié)構(gòu)處于非共軛體系，因此無熒光發(fā)射;當(dāng)與被檢測物作用時，探針螺環(huán)被打開，氧雜蒽結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為共軛體系，因此有熒光發(fā)射;探針由無熒光到有熒光，此謂熒光增強(turn on)型探針。反之，當(dāng)螺環(huán)由打開到關(guān)閉，氧雜蒽結(jié)構(gòu)由共軛到非共軛，探針則由有熒光到無熒光，謂之為熒光淬滅(turn off)型探針。正因為該熒光團(tuán)的熒光發(fā)射機理明確，所以這為該類熒光團(tuán)探針的設(shè)計提供了明確思路。
　　此外，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，生物體內(nèi)的髓過氧化

5、物酶MPO在酸性條件下具有更高的活性，有利于催化H2O2與Cl-反應(yīng)而生成HOCl，故推測生物體內(nèi)的HOCl極有可能是在酸性條件下生成的。因此，發(fā)展適用于酸性條件下韻次氯酸熒光探針對檢測生物體內(nèi)的次氯酸來源具有重要的意義。
　　鑒于開發(fā)次氯酸熒光探針的重要意義以及熒光比率探針的獨特優(yōu)勢，本論文主要致力于次氯酸熒光比率探針的研究。設(shè)計、合成了一系列基于羅丹明類熒光團(tuán)的次氯酸熒光比率探針CRH、CRA、Naph-Rh、CRSH、CAR

6、SH和DRSH，以及一種Hg2+熒光探針RDH，并對它們的光譜性質(zhì)及應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。
　　第一章，簡述了發(fā)展次氯酸熒光探針的重要意義;簡單介紹了熒光探針的識別機理及羅丹明類熒光團(tuán)探針的設(shè)計原理;總結(jié)了次氯酸探針的研究進(jìn)展。
　　第二章，設(shè)計了兩個基于香豆素與羅丹明雙熒光團(tuán)的次氯酸熒光比率探針CRH與CRA。其中，CRH以雙酰肼為識別團(tuán)，能夠在堿性條件下對-OCl做出快速響應(yīng);CRA則直接以羅丹明酸為識別基團(tuán)，能夠在酸性

7、條件下對HOCl做出快速響應(yīng)。研究結(jié)果表明探針CRH與CRA對-OCl/HOCl表現(xiàn)出極高的選擇性和靈敏性。
　　第三章，設(shè)計了基于TBET原理的次氯酸熒光比率探針Naph-Rh。該探針將萘甲?；c羅丹明硫代酰肼相連接構(gòu)建了單硫代雙酰肼結(jié)構(gòu)。單硫代雙酰肼與HOCl作用后，生成噁二唑環(huán)，不僅轉(zhuǎn)化為共軛體系，而且誘導(dǎo)了羅丹明部分的螺環(huán)打開，使供體與受體之間建立起TBET過程。研究結(jié)果表明該探針選擇性好、靈敏度高、響應(yīng)快、適用于細(xì)胞的內(nèi)

8、源性HOCl的檢測。
　　第四章，設(shè)計了基于FRET原理的次氯酸熒光比率探針CRSH。該探針以香豆素與羅丹明為熒光母體，硫代酰肼為檢測基團(tuán)，在酸性條件下能夠與HOCl較快地發(fā)生作用而引起熒光團(tuán)的熒光變化，從而達(dá)到檢測HOCl的目的。研究結(jié)果顯示該探針具有良好的選擇性、較高的靈敏度、優(yōu)異的靈敏性、極強的膜透性以及良好的穩(wěn)定性，能夠很好地應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)HOCl的檢測。
　　第五章，在CRSH探針的基礎(chǔ)上，為了增加供體發(fā)射峰與受體吸

9、收峰之間的有效重疊面積，提高能量轉(zhuǎn)移效率，我們設(shè)計、合成了兩種基于FRET原理的次氯酸熒光比率探針CARSH與DRSH。在這兩個探針中，我們選擇了發(fā)射波更長的熒光團(tuán)（香豆素丙烯?；c丹磺酰基）作為能量供體與羅丹明熒光團(tuán)受體匹配建立了新的FRET模板。能量轉(zhuǎn)移效率計算結(jié)果顯示新模板有效地促進(jìn)了供體與受體之間的能量轉(zhuǎn)移。
　　第六章，基于羅丹醇熒光團(tuán)，設(shè)計了一種結(jié)構(gòu)簡單的Hg2+熒光探針RDH，并對其光譜性質(zhì)及細(xì)胞應(yīng)用進(jìn)行了研究。研究

10、結(jié)果表明探針RDH選擇性高、靈敏度好、抗干擾能力強、細(xì)胞毒性低，適宜應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)Hg2+的檢測。
　　本論文主要創(chuàng)新點:
　　1、基于FRET、TBET原理，選擇了不同的供體熒光團(tuán)與羅丹明類熒光團(tuán)搭配，設(shè)計了一系列適用于酸性條件下的次氯酸熒光比率探針CRA、Naph-Rh、CRSH、CARSH及DRSH。在酸性條件下，生物體內(nèi)MPO能夠更有效催化生成HOCl，因此發(fā)展適用于酸性條件下的次氯酸熒光探針對研究生物體內(nèi)的次氯酸來源

11、具有重要意義，但是，檢測酸性條件下的次氯酸的熒光探針尚不多見。本論文發(fā)展的探針在酸性條件下能夠?qū)OCl做出快速響應(yīng)，并適用于細(xì)胞內(nèi)HOCl成像。這些比率探針在消除環(huán)境、濃度、激發(fā)光強度變化的干擾，以及提高細(xì)胞成像的分辨率等方面具有明顯優(yōu)勢。
　　2、發(fā)展了首個基于第三代羅丹明類FRET模板的次氯酸熒光比率探針CRH（香豆素-羅丹明雙酰肼）。在對探針CRH的光譜性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)-OCl濃度超過一定量時，兩個熒光發(fā)射峰的升降發(fā)生逆

12、反，本文對這一現(xiàn)象做了進(jìn)一步研究，研究發(fā)現(xiàn)CRH與-OCl反應(yīng)的產(chǎn)物（香豆素-羅丹明酸，CRA）能夠進(jìn)一步發(fā)生氯代反應(yīng)。氯代反應(yīng)誘導(dǎo)了羅丹明部分的螺環(huán)重新關(guān)閉，從而導(dǎo)致熒光發(fā)射的逆轉(zhuǎn)。我們據(jù)此機理（氯代誘導(dǎo)羅丹明關(guān)環(huán)）將CRA開發(fā)為了一種新型檢測機理的次氯酸熒光比率探針，它能夠在酸性條件下對HOCl快速響應(yīng)，且適用于細(xì)胞內(nèi)源性HOCl成像。
　　3、探針Naph-Rh是首個基于TBET原理的次氯酸熒光比率探針，彌補了基于該原理的次

13、氯酸探針的空白。該探針以發(fā)射波長較短的萘熒光團(tuán)作為能量供體，在能量轉(zhuǎn)移效率較高(84％)的前提下，顯著增加了偽-Stokes位移(235 nm)，有利于提高細(xì)胞成像的分辨率。
　　4、為了增大供體發(fā)射峰與受體吸收峰之間的重疊，提高能量轉(zhuǎn)移效率，在探針CRSH的基礎(chǔ)上，我們采用了發(fā)射波長更長的熒光團(tuán)（香豆素丙烯?；c丹磺酰基）為能量供體，設(shè)計了兩個次氯酸熒光比率探針CARSH與DRSH，這兩個探針同樣適用于酸性條件下檢測次氯酸，且它