離子交換層析柱和填料 選擇指南

1、離子交換層析柱和填料選擇指南GE醫(yī)療中國(guó)GE夢(mèng)想啟動(dòng)未來(lái)樣品制備為了獲得最佳的分離并避免層析柱性能的退化，正確的樣品制備是必要的。樣本必須是澄清的，無(wú)顆粒物質(zhì)。為了去除顆粒物質(zhì)，過(guò)濾（過(guò)濾器孔徑見(jiàn)緩沖液配制）或離心（10000 g，15分鐘）樣品。脫鹽樣品使用HiTrap? Desalting 5 ml（體積達(dá)到1.5 ml）或HiPrep? 26/10 Desalting（體積達(dá)到15 ml）轉(zhuǎn)換為所選擇的其實(shí)緩沖液。在高鹽濃度下不含

2、主要污染的非常小體積的樣品可以用起始緩沖液稀釋，以降低鹽濃度到不干擾填料的水平結(jié)合。層析柱準(zhǔn)備在使用任何IEX填料前洗掉保存溶液和防腐劑。使用預(yù)裝層析柱以保證最好的性能分離效果和可重復(fù)的結(jié)果所需要的填充床體積是由待純化樣品的量和填料的結(jié)合容量決定。裝柱，層析柱將具有超過(guò)所需要結(jié)合容量大約5倍的結(jié)合容量，柱床高度達(dá)到20 cm。緩沖液配制有關(guān)揮發(fā)性和非揮發(fā)性緩沖系統(tǒng)的建議見(jiàn)表1。緩沖離子應(yīng)該具有與IEX填料上功能基團(tuán)相同的電荷，pKa值在

3、工作pH的0.6 pH內(nèi)。使用的緩沖液濃度足以維持緩沖能力和恒定的pH，一般為20–50 mM。在所有鹽和添加劑被加入后過(guò)濾緩沖液，并始終使用高質(zhì)量的水和化學(xué)試劑。對(duì)于顆粒大小> 90 μm使用1 μm濾膜，對(duì)于34 μm顆粒使用0.45 μm濾膜，或者對(duì)于顆粒大小< 15 μm，或當(dāng)需要無(wú)菌或需要極其干凈的樣品時(shí)使用0.22 μm濾膜。為了避免氣泡產(chǎn)生，確保層析柱和緩沖液在相同溫度下。對(duì)于具有未知電荷性質(zhì)的樣品，請(qǐng)嘗試下列

4、條件：- 陰離子交換（Q）起始緩沖液：pH 8.0洗脫緩沖液：含有1 M NaCl的起始緩沖液，pH 8.0- 陽(yáng)離子交換（S或SP）起始緩沖液：pH 6.0洗脫緩沖液：含有1 M NaCl的起始緩沖液，pH 6.0方法開(kāi)發(fā)與優(yōu)化（按照優(yōu)先順序）通過(guò)測(cè)試一系列PH值尋找最佳PH，在這些PH值中感興趣的蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。如果目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)已知，則以更窄的pH范圍開(kāi)始，例如可以從離等電點(diǎn)0.5–1 pH單位。如果需要，使用自

5、動(dòng)化填料搜索程序搜索最佳選擇性（測(cè)試強(qiáng)或弱的交換劑）。搜索在選定pH下提供合格分辨率的最陡梯度。搜索保持分辨率和盡可能減少分離時(shí)間的最高流速。檢查對(duì)于待定填料的推薦流速。搜索可以上樣同時(shí)維持滿意的分辨率的最大上樣量。通常，上樣20–30%層析柱總結(jié)合容量提供采用梯度洗脫的最佳分辨率。6.對(duì)于大規(guī)模純化，通過(guò)轉(zhuǎn)變?yōu)閳D3所示的階段洗脫可以減少分離時(shí)間和緩沖液消耗。5–10 CV 5–10 CV] l C a N [層析柱體積（CV）平衡 再

6、平衡樣品 進(jìn)樣體積不結(jié)合 分子洗脫不要的 物質(zhì)洗脫目標(biāo) 分子洗脫緊密結(jié)合的 分子洗脫高鹽洗滌01 M圖3.使用階段洗脫的典型IEX分離層析柱清洗樣品和緩沖液的正確制備和每次分離結(jié)束時(shí)高鹽洗滌的應(yīng)用應(yīng)該能夠保持大多數(shù)層析柱在良好的條件。然而，性能降低、流速變慢、背壓增加或完全堵塞都是填料需要被更嚴(yán)格的條件清洗以去除污染物的種種表現(xiàn)。建議在層析柱清洗期間逆向流動(dòng)，以便使污染物不需要通過(guò)整根層析柱。對(duì)于每個(gè)清洗步驟所需要的柱體積數(shù)和時(shí)間根據(jù)污