微流控高通量生物分析：從單細胞到復雜生物微環(huán)境.pdf

1、隨著人類基因組計劃的完成，生命科學進入了后基因組時代，為了進一步揭開生命的奧秘，所需的生物信息規(guī)?？涨暗谋ā＝⑿乱淮咄康纳锓治黾夹g(shù)是當今許多研究領域的迫切需求。建立高通量的生物信息獲取技術(shù)將廣泛應用于基因組學，蛋白組學，藥物篩選，干細胞分化等諸多領域。然而生物信息的高通量獲取依然是一個巨大的挑戰(zhàn)，其挑戰(zhàn)主要來自兩方面：一方面是如何更精準地獲取生物學信息，如單細胞信息；另一方面是如何從更為真實的復雜生物微環(huán)境中高通量地獲取生物學

2、信息。傳統(tǒng)的高通量分析方法主要是基于流式細胞，微孔板檢測器和點樣儀。其局限性在于無法準確的記錄單細胞的動態(tài)響應，并且不能重建復雜三維的細胞微環(huán)境。近年來，微流控芯片由于其精確可控，高通量，尺度與細胞組織相匹配等優(yōu)點受到了廣泛的關(guān)注。同時基于微流控芯片的高通量分析呈現(xiàn)多元化發(fā)展，以滿足不同領域的需求。本文針對單細胞和復雜生物微環(huán)境的高通量分析，建立了基于瓊脂糖水凝膠、表面潤濕性圖案化和PDMS微通道的三類微流控芯片。
　　本研究主要

3、內(nèi)容包括：⑴建立一種基于瓊脂糖微流控芯片的高通量單細胞基因組損傷分析方法。該方法可以在一塊芯片上同時檢測多至10000個細胞的單細胞基因組損傷，在保證更好的重現(xiàn)性的前提下，通量上相比傳統(tǒng)方法提高了一百倍。通過采用瓊脂糖作為微流控芯片的加工材質(zhì)，利用瓊脂糖的超親水特性自動進樣細胞并在通道內(nèi)自動排列形成單細胞陣列。隨即包埋細胞于瓊脂糖微流體芯片中，并裂解電泳，分離并檢測損傷DNA。該方法同樣可以用于單細胞DNA損傷修復的研究，可廣泛應用于藥

4、物篩選和細胞毒性實驗等領域。⑵建立一種自定義濃度梯度芯片用于高通量單細胞多藥耐藥性分析。該芯片所形成的濃度梯度由分配通道長短比例決定，與液體流速和驅(qū)動壓力無關(guān)，該設計保證了濃度梯度形成的穩(wěn)定性并簡化了芯片設計易于集成化。該芯片可以在單細胞乃至單細胞器水平分析數(shù)百個的細胞的多藥耐藥性，可以實時監(jiān)控單細胞的藥物外流。更進一步的，該方法可以用于化療增強劑的高通量篩選。⑶建立一種低成本，快速且便攜化的細菌富集和檢測裝置。該芯片由瓊脂糖材質(zhì)加工而

5、成，利用瓊脂糖材質(zhì)的超親水性和水滲透性，自動進樣細菌懸液于微通道中，由于該芯片通道末端封閉設計，細菌被富集收集于通道末端。該芯片最多可以實現(xiàn)細菌樣品一千萬倍的富集。在一百萬倍富集的條件下，其細菌捕獲效率高達90％以上。該方法被證實同樣可以用于血液樣品和尿液樣品的富集檢測。通過結(jié)合免疫熒光染色，該方法成功檢測到了臨床病人樣品中感染的細菌。⑷建立基于三維梯形微流體通道的細胞密度梯度組裝新方法，通過控制微流體通道不同區(qū)域范圍內(nèi)通道高度，在均一

6、的細胞懸液通入微流體通道后，待細胞隨重力沉降，便能形成細胞密度梯度。通過該方法組裝細胞密度梯度可在10分鐘內(nèi)完成?；谠摲椒ㄍㄟ^順序組裝可以組裝成多細胞種類細胞密度梯度。通過改變?nèi)S微流體通道中單層通道的形狀可以控制細胞密度梯度的圖案化。該組裝方法可以模擬真實組織中的細胞密度梯度，重建其細胞間相互作用。該細胞模型可以用于高通量研究該復雜細胞微環(huán)境下細胞的行為和功能，我們研究發(fā)現(xiàn)在不同細胞密度下對碲化鎘量子點毒性的耐受性有不同的表現(xiàn)。⑸基

7、于表面潤濕性的異質(zhì)性復雜生物微環(huán)境高通量組裝平臺，我們進一步提出了一種可以同時高通量組裝數(shù)以千計異質(zhì)性生物微環(huán)境的方法。采用該表面潤濕性圖案化芯片，最多可以在數(shù)秒內(nèi)同時加工百萬計的單一組分液滴/微凝膠陣列。通過對單一組分液滴陣列融合與分裂等操作，可以在10分鐘內(nèi)組裝數(shù)以千記的異質(zhì)性細胞微環(huán)境陣列。該方法可以精確控制陣列中每一個細胞微環(huán)境陣列中的物理信號（包括圖案化，材料的機械性能等），材料組成，化學信號（化學濃度，和多組分化學因子空間分

8、布）以及細胞間相互作用（細胞密度梯度以及多細胞種類空間分布與相互作用）。該方法可以做為一種高通量分析平臺，廣泛用于組織工程，藥物篩選和干細胞研究等領域。⑹基于表面潤濕性的異質(zhì)性復雜土壤-微生物微環(huán)境高通量組裝平臺，我們將其命名為芯片微地球。采用該表面潤濕性圖案化芯片，最多可以在數(shù)秒內(nèi)同時加工數(shù)萬計的單一組分土壤微環(huán)境。也可以通過結(jié)合點樣，在十分鐘內(nèi)加工幾百個異質(zhì)性的土壤異質(zhì)性微環(huán)境陣列。我們可以精確控制土壤微環(huán)境中的圖案化，土壤礦物質(zhì)成

9、分，土壤有機質(zhì)含量和成分，土壤微生物菌落等。通過微流體芯片，可以精確控制土壤周圍的化學微環(huán)境，其中包括離子強度，酸堿度等因素。我們接著在該土壤芯片模型上研究了土壤的動態(tài)組裝過程，我們觀察到均一性的土壤懸液在組裝過程中，土壤有機質(zhì)和細菌會組裝至土壤微生物復合物的邊緣和角落。其現(xiàn)象原理同咖啡圈效應，且該組裝中的異質(zhì)性分布與其土壤的礦物組成成分之間有著一定的規(guī)律。該芯片模型模擬的現(xiàn)象重建了真實土壤形成過程中組分異質(zhì)性分布的過程，并證明了物理作