轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2對(duì)體外培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性和形態(tài)的影響及其分子機(jī)理.pdf

1、角膜內(nèi)皮細(xì)胞是存在于角膜靠近于房水面的六角形鑲嵌排列的單層細(xì)胞,對(duì)維持角膜的透明有著關(guān)鍵作用。成年人角膜內(nèi)皮細(xì)胞(HCEC)缺乏增殖能力,局部細(xì)胞受到損傷后,只能通過(guò)鄰近細(xì)胞體積的增大和移行來(lái)填補(bǔ)缺損區(qū),所以六角形HCEC的數(shù)量逐年減少,角膜透明度逐漸降低?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明,HCEC停留在細(xì)胞周期的早G1期,仍然保持有增殖的潛能。但關(guān)于HCEC停留在G1期的具體的細(xì)胞與子機(jī)制,至今仍不清楚。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)屬

2、于TGF-β超家族的成員,具有調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及組織的損傷后修復(fù)等作用。TGF-β2是存在于人房水中的主要的TGF-β類型,可促進(jìn)小鼠角膜上皮層和基質(zhì)層的正常發(fā)育及內(nèi)皮層的形成,抑制體外培養(yǎng)的大鼠、兔和牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、調(diào)控牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成以及角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷后修復(fù)。有關(guān)TGF-β2對(duì)HCEC增殖活性和形態(tài)的影響及相關(guān)的分子機(jī)理,至今還未見(jiàn)到相關(guān)的報(bào)道。
　　 為了探明TGF-β2對(duì)HCEC增殖活性

3、的影響及相關(guān)的細(xì)胞和分子機(jī)理,本文利用體外培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系,使用不同濃度的TGF-β2在含10％FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)條件下處理HCEC,發(fā)現(xiàn)1～15ng/mL的TGF-β2對(duì)HCEC的增殖均有抑制作用,在1～9ng/mL的濃度范圍內(nèi),TGF-β2對(duì)HCEC增殖的抑制作用具有濃度依賴性,其中9ng/mL為TGF-β2對(duì)HCEC增殖的峰值抑制濃度;9ng/mL的TGF-β2處理HCEC的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,TGF-β2處理12

4、h即可抑制HCEC的增殖,抑制作用具有時(shí)間依賴性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,9ng/mLTGF-β2處理后,處于G1/G0期HCE細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(P<0.05),并具有時(shí)間依賴性。熒光定量PCR結(jié)果顯示,9ng/mLTGF-β2處理24h后,HCEC對(duì)p27kip1的表達(dá)量顯著增加,48h后p27kip1和印p21ciP1的表達(dá)量均顯著增加,也具有時(shí)間依賴性。以上結(jié)果說(shuō)明,TGF-β2對(duì)HCEC具有顯著的增殖抑制作用,并具有濃度和時(shí)間

5、依賴性,其抑制作用機(jī)理很可能是通過(guò)先后誘導(dǎo)p27kip1和p21cip1表達(dá)量的增加進(jìn)而將細(xì)胞拘留在G1/G0期來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 為了探明TGF-β2對(duì)HCEC形態(tài)的影響及相關(guān)的分子機(jī)理,本文首先采用1～15ng/mL的TGF-β2在含10％FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)條件下處理HCEC,光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果顯示,3～15ng/mL的TGF-β2處理72h可明顯增加細(xì)胞的貼瓶面積,在3～9ng/mL的濃度范圍內(nèi),TGF-β2

6、對(duì)HCEC形態(tài)改變具有濃度依賴性,其中9ng/mL為TGF-β2對(duì)HCEC形態(tài)的峰值改變濃度;9ng/mL的TGF-β2處理HCEC的光鏡觀察結(jié)果顯示,TGF-β2處理HCEC 24h即可增加單個(gè)細(xì)胞的鋪展面積,促進(jìn)細(xì)胞由上皮細(xì)胞樣變?yōu)槌衫w維細(xì)胞樣,形態(tài)的改變具有時(shí)間依賴性;細(xì)胞貼附實(shí)驗(yàn)表明,9ng/mL TGF-β2處理24h～72h均可明顯的增強(qiáng)HCEC貼附能力(P<0.05)。熒光雙染色結(jié)果顯示,9ng/mLTGF-β2處理24h

7、,可增加HCEC胞質(zhì)中F-肌動(dòng)蛋白絲和微管的長(zhǎng)度,降低細(xì)胞中心體區(qū)域的熒光強(qiáng)度;處理72h則明顯增加HCEC胞質(zhì)中微絲束的數(shù)量和長(zhǎng)度,并促進(jìn)微管遍布于整個(gè)胞質(zhì)空間;HCEC Ⅰ型和Ⅳ型膠原的免疫熒光染色的結(jié)果顯示,9ng/mLTGF-β2處理72h,可明顯增加HCEC單個(gè)細(xì)胞胞外Ⅳ型膠原的鋪展面積,降低其熒光強(qiáng)度;Western blot結(jié)果顯示,9ng/mLTGF-β2處理24h和72h對(duì)HCEC Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原的表達(dá)量均沒(méi)有顯著

8、的影響。以上結(jié)果說(shuō)明,TGF-β2通過(guò)增加平行于細(xì)胞長(zhǎng)軸方向的F-肌動(dòng)蛋白絲的數(shù)量、延長(zhǎng)F-肌動(dòng)蛋白絲和微管的長(zhǎng)度以及增加Ⅳ型膠原的鋪展面積,從而促進(jìn)HCEC由上皮細(xì)胞樣向成纖維細(xì)胞樣的轉(zhuǎn)變、增大單個(gè)細(xì)胞的鋪展面積和增強(qiáng)細(xì)胞的貼附能力。
　　 本文研究了TGF-β2對(duì)體外培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性和形態(tài)影響作用,旨在探明TGF-β2在人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和形態(tài)改變中的作用及其相關(guān)的細(xì)胞和分子機(jī)理,為深入研究人角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖