人胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)和性質(zhì)鑒定.pdf

1、目的：建立人胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇的方法，探索優(yōu)化人胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系。 方法：一、人胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞原代、傳代培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇方法及衰老細(xì)胞檢測.1、原代培養(yǎng).無菌操作獲取胎兒角膜片，貼壁法(角膜片切割成周邊和中央塊分別貼壁)、揭膜法和消化法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)液用DMEM/F12+10％胎牛血清，常規(guī)條件培養(yǎng)。2、傳代培養(yǎng)及凍存復(fù)蘇.細(xì)胞生長匯合達(dá)80％時，用不同濃度的胰酶/EDTA、膠

2、原酶-I等37℃消化5-30分鐘不等，按1：2比例傳代接種，并常規(guī)換培養(yǎng)液培養(yǎng)。用90％胎牛血清加10％DMSO配制成細(xì)胞凍存液將培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞凍存。3、β-半乳糖苷酶原位染色，對出現(xiàn)衰老狀態(tài)的P3代胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞，按試劑盒說明進(jìn)行β-半乳糖苷酶原位細(xì)胞染色，鏡下觀察染色情況。二、胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化.將傳代內(nèi)皮細(xì)胞以合適濃度接種于96孔培養(yǎng)板，第二日待細(xì)胞貼后分別換人胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、含2.5％、5％、10％

3、、20％的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液以及DMEM/F12+10％FBS。培養(yǎng)適當(dāng)時間后，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，多功能酶標(biāo)儀讀取各孔細(xì)胞OD490值。三、胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定，將傳代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞用NSE、nestin、ZO-1、Ki67、CK-3/12和vimentin抗體進(jìn)行熒光染色，觀察傳代細(xì)胞是否保持有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的特性，以角膜基質(zhì)細(xì)胞作為陰性對照。收集傳代角膜內(nèi)皮細(xì)胞總mRNA，檢測Na+-K+-ATP酶、ZO-1在基因

4、水平上的表達(dá)情況，以角膜基質(zhì)細(xì)胞作為對照：對P3代衰老角膜內(nèi)皮細(xì)胞基因水平p16、SOD2和Ki67的表達(dá)進(jìn)行定量檢測，以原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞為對照。對固定的胎兒角膜進(jìn)行組織切片并用HE染色觀察內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)。四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MTT法檢測結(jié)果，SPS.11.5軟件包對MTT法檢測的結(jié)果進(jìn)行組問比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：一、胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長情況觀察，1、原代培養(yǎng).角膜組織塊貼壁培養(yǎng)三天后，鏡

5、下可見內(nèi)皮細(xì)胞沿組織塊邊緣爬出，隨著培養(yǎng)時間延長細(xì)胞呈鋪路石樣向周邊鋪展擴(kuò)增，大部細(xì)胞形態(tài)呈規(guī)則多邊形、生長狀態(tài)良好。2、細(xì)胞傳代、凍存復(fù)蘇和衰老細(xì)胞染色0.125/0.02或0.25/0.02胰酶/EDT.37℃條件下消化5-10分鐘可觀察到：角膜周邊組織塊培養(yǎng)的原代內(nèi)皮細(xì)胞消化后大部分細(xì)胞呈單細(xì)胞狀態(tài)，1：2傳代培養(yǎng)可見細(xì)胞貼壁生長，3-5天后可見形態(tài)規(guī)則的多邊形小細(xì)胞集落分布于不規(guī)則的大細(xì)胞間并有明顯有擴(kuò)增；但是角膜中央組織塊培養(yǎng)

6、細(xì)胞傳代后少見有可擴(kuò)增的小細(xì)胞集落較易衰老。連續(xù)傳3代后的內(nèi)皮細(xì)胞，貼壁和增殖能力明顯減弱，細(xì)胞形態(tài)變大不規(guī)則、胞質(zhì)內(nèi)空泡漸增多，細(xì)胞數(shù)量漸少，β-半乳糖苷酶原位染色后見含空泡的大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈藍(lán)色著色，不含空泡的小細(xì)胞胞質(zhì)未見明顯著色。凍存復(fù)蘇后的角膜內(nèi)皮細(xì)胞能貼壁生長可見擴(kuò)增，貼壁率與未凍存的細(xì)胞相近。二、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MTT法檢測的結(jié)果.胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、含2.5％、5％、10％、20％牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液和DMEM/

7、F12+10.FBS培養(yǎng)液對胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，4-5天后MTT法測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果經(jīng)多組間方差分析顯示(F=0.08.P>0.05).DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)液和胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液與含2.5％、5％、10％濃度牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液比較，差異均有顯著性意義，其中5％濃度組OD值最高，對角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果更明顯。三、胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定，1、細(xì)胞免疫熒光檢測，傳代的胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞用NSE、ne

8、stin、ZO-1、Ki67、CK-3/12和vimentin抗體進(jìn)行了熒光染色，共焦顯微鏡下觀察，見胞膜有抗體ZO-1陽性染色，胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)抗體NSE和nestin陽性染色；胞核有強(qiáng)弱不等的Ki67抗體陽性染色；抗體CK-3/12和vimentin均無明顯陽性染色。2、細(xì)胞分子生物學(xué)檢測. RT-PCR檢測顯示，胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞在基因水平上均有Na+-K+-ATP酶和ZO-1的高表達(dá)，而角膜基質(zhì)細(xì)胞幾乎無表達(dá)；P3代角膜內(nèi)皮細(xì)胞中p16

9、和SOD2表達(dá)量顯著升高而Ki67的表達(dá)下降，表明體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖能力降低，逐漸衰老。3、角膜切片組織化學(xué)檢測@..對固定的角膜鋪片進(jìn)行HE染色，見周邊部內(nèi)皮細(xì)胞呈立方形緊密排列，而中央部單層內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平狀緊密連接。 結(jié)論：1、組織塊法是一種有效的體外培養(yǎng)原代人胎兒角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方法；2、原培養(yǎng)皿1：2連續(xù)傳代法可以將角膜內(nèi)皮細(xì)胞傳5代以上；3、角膜周邊部內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于中央部；4、90％FBS+10％DMSO凍存方法可以