生長素響應(yīng)因子GhARF6對(duì)棉花生長發(fā)育的影響.pdf

1、棉花是關(guān)系國計(jì)民生的重要物資，在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要的地位。生長素可以調(diào)控細(xì)胞的伸長、分裂和分化，不定根的形成、果實(shí)的發(fā)育和胚的形成等。生長素通過其信號(hào)途徑對(duì)功能基因進(jìn)行調(diào)控，從而影響植物的生長發(fā)育。因此，生長素信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其對(duì)下游基因的調(diào)控機(jī)理是近年來植物生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。棉花中生長素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的生物學(xué)功能進(jìn)行研究，有助于解生長素在棉花生長發(fā)育以及形態(tài)建成過程中所發(fā)揮的作用，在闡明棉花中生長素信號(hào)傳導(dǎo)的復(fù)雜分子機(jī)制方面具有重

2、要的理論意義。ARFs（Auxin response factors）基因家族的發(fā)現(xiàn)，使人們對(duì)生長素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的認(rèn)識(shí)有了突破性的進(jìn)展。
　　ARF6基因與植物頂端分生組織的生長、維管組織的發(fā)育、解除頂芽休眠和花器官的發(fā)育相關(guān)。為了進(jìn)一步解析ARF6基因在陸地棉發(fā)育過程中的功能，本論文首先克隆了GhARF6基因，分析其啟動(dòng)子的表達(dá)特性。通過調(diào)控GhARF6基因在棉花中的表達(dá)水平，來探究GhARF6基因?qū)γ藁ㄉL發(fā)育的影響。具體研究

3、結(jié)果如下：
　　1. GhARF6基因的克隆與表達(dá)特性分析
　　首先從陸地棉中克隆了ARF6基因的同源基因GhARF6基因。該基因位于26條染色體中的5號(hào)染色體上，其含有一個(gè)2715 bp的ORF框，編碼904個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為99.78 kDa，pI=6.33。擬南芥中ARFs被分為5類，將檢索到的96個(gè)陸地棉ARF基因與擬南芥ARF基因各個(gè)分類中具有代表性的10個(gè)基因氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析顯示：陸地棉中含有8個(gè)

4、 ARF亞家族，與 GhARF6基因相似度高的GhARF6-1和GhARF6-2與AtARF6、AtARF8分在了同一個(gè)亞家族，且與AtARF6基因同源性較高。對(duì)GhARF6基因氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析顯示其具有典型的ARF蛋白結(jié)構(gòu)，并且在440-620氨基酸之間富集了谷氨酰胺（Q），推測其為轉(zhuǎn)錄激活子。在棉花中進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)GhARF6基因在棉花植株的各個(gè)部位均有表達(dá)，莖中表達(dá)水平相對(duì)最高，是葉片中表達(dá)水平的10.1倍。在纖維和胚珠生長發(fā)

5、育過程中表達(dá)分析顯示該基因在0-4 DPA的纖維中相對(duì)表達(dá)水平較高，0-6 DPA的胚珠中相對(duì)于其他階段表達(dá)水平較高，并在開花后6天的胚珠中達(dá)到頂峰。預(yù)示該基因在胚珠發(fā)育起始階段發(fā)揮重要作用。
　　用不同激素對(duì)棉花幼苗進(jìn)行處理，結(jié)果顯示：GhARF6基因在子葉、下胚軸和根部均有表達(dá)。GhARF6基因在IAA、NPA、NAA處理的子葉中表達(dá)水平相對(duì)較高，相對(duì)表達(dá)水平分別是未處理的12.7倍、11.5倍、9.0倍；用IAA、NAA、N

6、PA處理后下胚軸中GhARF6基因的相對(duì)表達(dá)水平是未處理的8.3倍、3.4倍、4.2倍；在根部的表達(dá)水平在處理前后無明顯變化。
　　用不同濃度的 Al3+處理棉花幼苗發(fā)現(xiàn)：0?M、25?M、50?M Al3+濃度下GhARF6基因隨著Al3+濃度的增加表達(dá)量增加，Al3+濃度為50?M時(shí)GhARF6基因表達(dá)水平達(dá)到最高。50?M、100?M、200?M Al3+濃度下GhARF6基因的表達(dá)水平隨著Al3+濃度的增加而下降。將棉花幼

7、苗在50?M Al3+的培養(yǎng)液中進(jìn)行了不同時(shí)間段的處理，發(fā)現(xiàn)GhARF6基因的表達(dá)量在0-3 h內(nèi)上調(diào)，3 h后開始下降，9h后表達(dá)水平恢復(fù)到未處理前的水平。
　　2. GhARF6基因啟動(dòng)子克隆及表達(dá)特性分析
　　為了進(jìn)一步了解GhARF6基因的功能，課題組前期克隆了該基因上游2100 bp的啟動(dòng)子序列，經(jīng)PlantCARE網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)該序列含有眾多的植物順式元件，包含生長素響應(yīng)元件、光響應(yīng)相關(guān)元件、組織表達(dá)相關(guān)元件、水楊

8、酸響應(yīng)元件、防御及脅迫響應(yīng)的相關(guān)元件、特定部位表達(dá)相關(guān)的元件等。將該啟動(dòng)子與GUS基因融合后分別轉(zhuǎn)化棉花和擬南芥，組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：擬南芥中該啟動(dòng)子主要在轉(zhuǎn)基因植株的蓮座葉、角果、花柄、花絲、柱頭頂部、主根、側(cè)根和根毛中表達(dá)。其中在花柄、主根和側(cè)根中表達(dá)活性相對(duì)較強(qiáng)，GUS基因在轉(zhuǎn)基因棉花植株的各個(gè)部位均有表達(dá)，主要集中在莖、下胚軸、根的維管束組織中。該基因啟動(dòng)子在擬南芥與棉花中的表達(dá)模式基本相一致。
　　對(duì)PGhARF6轉(zhuǎn)基因擬

9、南芥用Al3+處理后發(fā)現(xiàn)：用50?M Al3+處理9 h后擬南芥的根尖、下胚軸、子葉相對(duì)未處理著色深。
　　3.調(diào)控GhARF6基因影響棉花生長發(fā)育
　　為了進(jìn)一步探究陸地棉中GhARF6基因的生物學(xué)功能，構(gòu)建CaMV35S組成型啟動(dòng)子控制的GhARF6基因反義抑制表達(dá)載體、超量表達(dá)載體、RNA干擾表達(dá)載體，并分別對(duì)棉花進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花植株進(jìn)行表型觀察發(fā)現(xiàn)：下調(diào)GhARF6基因后，棉花花器官呈現(xiàn)特異表型：花瓣小，雄

10、蕊短且花藥延遲釋放。同時(shí)伴隨著落鈴的現(xiàn)象，RNA干擾植株落鈴較為嚴(yán)重，有的達(dá)到了100％。上調(diào)GhARF6基因后，棉花花器官發(fā)育無明顯變化。
　　下調(diào)GhARF6基因后，種子變得不飽滿并且單株單個(gè)棉鈴中種子明顯減少：反義轉(zhuǎn)基因植株3-4-3、41-1-1和干擾轉(zhuǎn)基因植株2-2、2-4分別減少了42%、33.5%、39.6%、29.7%；對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花植株單株成熟纖維的長度測量發(fā)現(xiàn)：成熟纖維變短，這種表型在RNAi轉(zhuǎn)基因植株中更為明顯