多代近交對(duì)三疣梭子蟹能量代謝影響的研究.pdf

1、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國(guó)重要的大型海洋經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，已經(jīng)成我國(guó)重要的沿海地區(qū)漁業(yè)養(yǎng)殖對(duì)象，2015年三疣梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)117,772噸。由于三疣梭子蟹野生苗種的減少，為滿足養(yǎng)殖需要苗種不得不依靠人工蓄養(yǎng)的親本提供。因此可不避免地造成了三疣梭子蟹群體內(nèi)近交。然而近交增加了子代基因純合度和隱形有害基因突顯的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致三疣梭子蟹重要經(jīng)濟(jì)性狀的衰退。本研究系統(tǒng)地研究了近交對(duì)三疣梭子蟹氧化磷酸

2、化代謝和碳水化合物代謝關(guān)鍵酶及其基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步理解近交衰退的機(jī)制提供重要的基礎(chǔ)信息。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.三疣梭子蟹氧化磷酸化代謝在家系近交中的變化分析
　　為探究近交對(duì)三疣梭子蟹氧化磷酸化代謝的影響，首先采用RACE技術(shù)克隆獲得三疣梭子蟹線粒體呼吸鏈5個(gè)復(fù)合體關(guān)鍵亞基基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)這些基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。三疣梭子蟹線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ亞基基因cDNA序列全長(zhǎng)為1005bp，包含705b

3、p的ORF，編碼234個(gè)氨基酸，該蛋白是復(fù)合體Ⅰ的核心亞基Ndufv2，命名為ptNdufv2；復(fù)合體Ⅱ亞基基因cDNA序列全長(zhǎng)為915bp，包含540bp的ORF，編碼由179個(gè)氨基酸組成的復(fù)合體Ⅱ關(guān)鍵亞基SDHC，命名為ptSDHC；復(fù)合體Ⅲ亞基基因cDNA序列全長(zhǎng)為2371bp，包含942bp的ORF，編碼由313個(gè)氨基酸組成的Cytc1亞基，命名為ptCytochrome c1；復(fù)合體Ⅳ亞基基因cDNA序列全長(zhǎng)為1171bp，包

4、含318bp的ORF，編碼由105個(gè)氨基酸組成的COX6B亞基，命名為ptCOX6B；復(fù)合體Ⅴ亞基基因F-ATPaseβ基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1965bp，包含1053bp的ORF，編碼一個(gè)由350個(gè)氨基酸組成的ATP合酶β亞基，命名為ptF-ATPaseβ。這些基因與相近的物種同源性較高，在進(jìn)化上也表現(xiàn)出較高的保守性，可為其他海洋生物相關(guān)的研究提供參考。
　　分析了不同近交世代家系三疣梭子蟹的肝胰腺和心臟中線粒體呼吸鏈5個(gè)復(fù)合

5、體活力，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析這些復(fù)合體基因在不同近交世代家系三疣梭子蟹的肝胰腺和心臟中的表達(dá)情況。結(jié)果表明近交造成了三疣梭子蟹肝胰腺中全部5個(gè)復(fù)合體活力及其亞基基因的衰退，心臟中除復(fù)合體II之外4個(gè)復(fù)合體活力及其亞基基因的衰退，這一結(jié)果證實(shí)了近交衰退出現(xiàn)在了三疣梭子蟹氧化磷酸化代謝通路之中。
　　2.三疣梭子蟹碳水化合物代謝在家系近交中的變化分析
　　為分析三疣梭子蟹碳水化合物代謝在家系近交中的變化，本研究檢測(cè)了

6、不同近交世代家系的三疣梭子蟹碳水化合物代謝關(guān)鍵酶的活力及糖原含量，分析近交對(duì)其代謝酶活力的影響。利用RT-PCR的方法檢測(cè)了這些關(guān)鍵酶mRNA的相對(duì)表達(dá)的變化，分析近交對(duì)其基因表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨近交系數(shù)的增加，肝胰腺和肌肉中的己糖激酶(HK)活力顯著下降，丙酮酸脫氫酶(PK)在鰓和血清中也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，同時(shí)兩者基因相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)出和酶活同樣的下降趨勢(shì)，這表明了三疣梭子蟹糖酵解代謝的衰退；肌肉和鰓中琥珀酸脫氫酶(SDH)活力隨著

7、近交系數(shù)的增加不斷增強(qiáng)，這說(shuō)明三疣梭子蟹有氧代謝水平隨近交不斷增強(qiáng)。然而SDH基因相對(duì)表達(dá)量還是呈現(xiàn)衰退趨勢(shì)，這表明近交不可避免的造成了三疣梭子蟹有氧代謝關(guān)鍵基因(SDH)的衰退；乳酸脫氫酶(LDH)酶活力隨近交系數(shù)的增加沒(méi)有顯著變化，而LDH基因相對(duì)表達(dá)量卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明近交對(duì)三疣梭子蟹無(wú)氧代謝有著不利的影響。該結(jié)果證實(shí)了近交造成了三疣梭子蟹碳水化合物代謝的衰退。
　　3.三疣梭子蟹同家系大小個(gè)體之間碳水化合物代謝的差異

8、r>　　為分析體重分化與碳水化合物代謝之間的關(guān)系，本研究通過(guò)酶活檢測(cè)與RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了三疣梭子蟹同一近交家系中大小個(gè)體中碳水化合物代謝關(guān)鍵酶的活力及其基因相對(duì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示三疣梭子蟹大小個(gè)體在碳水化合物代謝方面有著顯著的差異：F6代中大個(gè)體肝胰腺和肌肉中及F10代肌肉中的HK活力顯著高于小個(gè)體；F6代大個(gè)體中肝胰腺、肌肉和鰓及F10代肝胰腺和鰓的PK活力顯著顯著高于小個(gè)體。這表明，無(wú)論是F6還是F10代中，三疣梭子蟹大個(gè)體的

9、糖酵解代謝相對(duì)于小個(gè)體要旺盛，分解利用碳水化合物的能力強(qiáng)。F6代大個(gè)體肝胰腺和鰓中及F10代的鰓中的SDH活力顯著高于小個(gè)體，表明三疣梭子蟹大個(gè)體的肝胰腺和鰓中的有氧代謝水平相對(duì)于小個(gè)體較高。F6代中大個(gè)體肝胰腺和鰓中的LDH活力顯著高于小個(gè)體，這說(shuō)明大個(gè)體無(wú)氧代謝的水平較小個(gè)體強(qiáng)。大個(gè)體的肝糖原和肌糖原含量均顯著高于小個(gè)體，這說(shuō)明大個(gè)體貯存的糖原較多，推測(cè)其血糖水平也較高，揭示了其生長(zhǎng)較快的原因。
　　4.三疣梭子蟹酵母雙雜交c

10、DNA文庫(kù)的構(gòu)建及PtF-ATPaseβ互作蛋白的初步篩選
　　本實(shí)驗(yàn)在Clontech公司構(gòu)建了三疣梭子蟹酵母雙雜交三框讀碼cDNA文庫(kù)，該文庫(kù)各質(zhì)量參數(shù)均達(dá)標(biāo)，且插入片段大小分布廣泛，多樣性良好，可用于利用酵母雙雜交技術(shù)篩選關(guān)鍵基因的互作蛋白。為解析三疣梭子蟹ATP合酶β亞基蛋白F-ATPaseβ的功能，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用In-Fusion Cloning技術(shù)和 Yeastmaker Yeast Transformation技術(shù)，構(gòu)建

11、了pGBKT7-PtATPaseβ誘餌載體。并利用酵母雙雜交技術(shù)在三疣梭子蟹酵母雙雜交三框讀碼cDNA文庫(kù)中初步篩選出ATP合酶β亞基蛋白的互作蛋白。經(jīng)過(guò)高度缺陷培養(yǎng)基的篩選、三框讀碼、回復(fù)雜交、測(cè)序及生物信息學(xué)分析，獲得三疣梭子蟹ATP合酶β亞基蛋白的互作蛋白如下：延伸因子2(elongation factor2)、法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Farnesoic acid O-methyltransferase)、60S核糖體蛋白L37-A(P

12、robable60S ribosomal protein L37-A)、核酸反轉(zhuǎn)錄酶樣蛋白(endonuclease-reverse transcriptase-like protein)、動(dòng)力蛋白激活蛋白亞基3(dynactin subunit3-like)、細(xì)胞色素 c氧化酶亞基VIb/cox12(putative cytochrome c oxidase subunit VIb/cox12)、蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3C(Protei

13、n phosphatase1 regulatory subunit3C)、線粒體NADH脫氫酶[輔酶]1β亞基2(NADH dehydrogenase[ubiquinone]1 beta subcomplex subunit2, mitochondrial)、S-methyl-5-thioribose激酶(S-methyl-5-thioribose kinase)、偽裝樣蛋白(masquerade-like protein)、假定蛋白(