虎眼萬年青中蔗糖合酶基因的克隆、表達及功能鑒定.pdf

1、大量研究表明，藥物的糖基化修飾在提高藥物活性、提高生物利用度、降低毒副作用等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而用于藥物糖基化修飾的核苷酸單糖供體（包括UDP-葡萄糖，UDP-葡萄糖醛酸，UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖、UDP-芹菜糖、UDP-半乳糖醛酸）則存在含量稀少、提取繁瑣和合成困難等問題，這種不易得性限制了藥物糖基化的進一步研究，不利于創(chuàng)新藥物的研制和社會可持續(xù)發(fā)展的需要。但是，合成生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為該問題的解決提供了新的思路和方法。依

2、據(jù)解析生物合成途徑，得到相關(guān)關(guān)鍵酶的信息，對相關(guān)的關(guān)鍵酶基因進行研究和組裝，就可實現(xiàn)上述核苷單糖的規(guī)模化制備。
　　在對上述核苷單糖的生物合成途徑進行解析時發(fā)現(xiàn)，UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸是合成上述所有核苷單糖的前體。因此，進一步解析UDP-葡萄糖，UDP-葡萄糖醛酸的生物合成途徑，并對合成途徑中的相關(guān)基因進行研究，是利用合成生物學(xué)技術(shù)合成上述核苷單糖的關(guān)鍵。在3條核苷單糖合成途徑中，因蔗糖合酶途徑最短，僅需一步反應(yīng)就可生

3、成UDP-葡萄糖，而UDP-葡萄糖在其它酶的進一步催化下可以生成多種核苷單糖，在核苷單糖的生物合成途徑中處于核心的地位。因此對蔗糖合酶基因進行研究可為最終的利用合成生物學(xué)技術(shù)制備核苷單糖打下良好的開端。
　　1、蔗糖合酶基因家族的克隆及表達
　　依據(jù)虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序得到的數(shù)據(jù)，通過提取虎眼萬年青總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計引物，利用巢式PCR克隆得到3條蔗糖合酶基因（OcSus）。利用In-Fusion原理設(shè)計引

4、物，構(gòu)建了原核表達載體。通過直接表達或與分子伴侶共表達的形式，實現(xiàn)了OcSus1、OcSus2和OcSus3的可溶性表達。
　　2、蔗糖合酶基因家族的功能鑒定
　　依據(jù)蔗糖合酶催化可逆反應(yīng)這一特點，分別從蔗糖合成反應(yīng)方向及分解反應(yīng)方向?qū)cSus1-3的功能進行了鑒定。利用硫酸蒽酮法對合成反應(yīng)方向進行功能鑒定，初步確定OcSus1-3均具有合成蔗糖的功能。對于蔗糖分解方向的反應(yīng)，我們利用反相離子對色譜進行檢測。并進一步通過質(zhì)

5、譜及反應(yīng)產(chǎn)物與標準品共進樣的方式對反應(yīng)產(chǎn)物進行進一步確認，確定了OcSus1-3具有分解反應(yīng)的功能。綜上，OcSus1-3均具有蔗糖合酶功能。
　　3、蔗糖合酶基因家族分解反應(yīng)底物偏好性研究
　　利用OcSus1、OcSus2和OcSus3分別對蔗糖和ADP、TDP、GDP、CDP、UDP進行催化，研究三者催化分解反應(yīng)的底物偏好性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者均可對UDP進行催化，此外OcSus1還可對TDP進行催化，但是反應(yīng)效率低于以蔗

6、糖和UDP為底物的反應(yīng)效率。
　　4、蔗糖合酶基因家族分解反應(yīng)酶學(xué)性質(zhì)研究
　　OcSus1-3催化蔗糖分解反應(yīng)的最適溫度，最適pH不盡相同。其中，OcSus1和OcSus3催化蔗糖分解反應(yīng)的最適溫度均為50℃，而OcSus2為37℃。對于催化蔗糖分解反應(yīng)的最適pH，OcSus1和OcSus2均為7.0，而OcSus3為5.0。此外，我們還測定了不同濃度二價金屬離子對OcSus1-3催化蔗糖分解反應(yīng)的影響，除Ca2+對三者具

7、有一定的促進作用外，其余二價金屬離子均產(chǎn)生了一定的抑制作用。我們還對OcSus1-3催化蔗糖分解方向的酶促動力學(xué)參數(shù)進行了測定。結(jié)果表明，OcSus1、OcSus2和OcSus3的UDP的Km值均低于蔗糖的Km值，即三者對UDP的親和力均高于蔗糖。此外OcSus2在三者之中對UDP的親和力最高，而OcSus1則是在三者之中對蔗糖的親和力最高的，并且OcSus1的Vmax最高，說明其在三者中的催化效率較高。
　　5、蔗糖合酶基因家族

8、的表達模式研究
　　利用RT-qPCR的方法，通過檢測OcSus1-3在O.caudatum不同組織中的表達水平，研究了OcSus1-3的表達模式，從而進一步推斷三者在O.caudatum可能具有的生理功能。研究結(jié)果表明，OcSus1和OcSus2可能負責(zé)O.caudatum中OCAP-2-1，OCAP-2-2，OCAP-3-1和OCAP-3-3這類含葡萄糖的多糖的生物合成;OcSus3則可能在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著一定的作用。