虎眼萬年青總皂苷干預(yù)肝癌發(fā)生發(fā)展的實驗研究.pdf

1、肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，防治工作還遠不如人意?；⒀廴f年青植物具有很好的抗腫瘤作用，體外實驗研究顯示強大抑瘤效果。本研究為了探討虎眼萬年青的抗肝癌作用及其機制，先建立大鼠肝癌病變模型后采用生物化學(xué)檢測法、病理形態(tài)學(xué)觀察法、免疫化學(xué)檢測法及PCR法等進行研究，為虎眼萬年青的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)的理論和實驗依據(jù)。因為虎眼萬年青皂苷（OSW-1）提取較難且昂貴，為此本研究以虎眼萬年青提取物總皂苷進行了防治肝癌的動物實驗。
　　全文第一部分

2、首先研究了虎眼萬年青總皂苷的提取工藝。結(jié)果顯示選擇8倍量85％乙醇提取3次，每次1.5小時為最佳提取條件；收集45%-95%乙醇大孔吸附樹脂洗脫液，減壓濃縮，獲得精制總皂苷。其次因為虎眼萬年青總皂苷成分較復(fù)雜，所以運用所提取的虎眼萬年青總皂苷進行了毒理研究，結(jié)果顯示小鼠的半數(shù)致死量（LD50）為3.2g/kg。最后制作了虎眼萬年青總皂苷干預(yù)的二乙基亞硝胺誘發(fā)的大鼠肝癌病變模型，結(jié)果顯示14周開始出現(xiàn)癌變，18周末成癌率100%，成活率6

3、0%。
　　全文第二部分研究了虎眼萬年青總皂苷作用于大鼠肝癌病變過程中血清學(xué)的影響。采用賴氏法檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),采用鱟試劑基質(zhì)顯色法檢測內(nèi)毒素，用比色分析法檢測超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）的含量。結(jié)果表明虎眼萬年青總皂苷能有效降低肝細胞損傷敏感指標(biāo)AST、ALT活性及血漿內(nèi)毒素水平。MDA含量在肝癌病變的損傷硬化及發(fā)生發(fā)展階

4、段逐漸增高；虎眼萬年青總皂苷具有降低MDA生成作用，尤以肝損傷硬化階段明顯。SOD在12周模型組顯著增高，與趨于正常組水平的模型14周、模型18周組均有統(tǒng)計學(xué)差異。SOD活力在虎眼萬年青作用的12周預(yù)防組低于12周模型組，且有統(tǒng)計學(xué)差異。而在14周、18周虎眼萬年青總皂苷作用組與相應(yīng)模型組間，無顯著差異。說明虎眼萬年青總皂苷干預(yù)SOD活性水平發(fā)生在肝損傷硬化階段。GSH-Px活力在模型組12周、14周、18周逐漸下降，相互間有顯著性差異

5、?；⒀廴f年青總皂苷作用組明顯提高GSH-Px活力，并與相應(yīng)的模型組間均有顯著性差異。虎眼萬年青總皂苷在促進、發(fā)生發(fā)展階段中能夠增加大鼠血清 GSH-Px的活力，提高抗氧化系統(tǒng)功能，降低對毒物的敏感性。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，血清中的NO濃度模型組14周時表達量最低，與各組間均有顯著性差異?；⒀廴f年青總皂苷作用組14周時NO量明顯升高，且與14周模型組具有顯著性差異?；⒀廴f年青總皂苷干預(yù)主要作用于肝癌發(fā)生階段。
　　全文第三部分動態(tài)

6、觀察了虎眼萬年青總皂苷作用后的肝組織病理形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)的變化。研究表明12周肝硬化階段模型組以出現(xiàn)增生結(jié)節(jié)，嗜堿性變，透明變，水變性為主；14周后模型組出現(xiàn)大量的“灶中灶”現(xiàn)象，18周模型組全部出現(xiàn)癌變。而虎眼萬年青總皂苷預(yù)防組12周時減少嗜堿性細胞結(jié)節(jié)以出現(xiàn)少量假小葉、纖細纖維間隔、灶狀變性為主。14周預(yù)防組假小葉、不規(guī)則纖維間隔、肝細胞灶狀水變性、脂肪變性為主。14周治療組以部分處肝硬化、變性輕度為特點。18周肝癌治療組出現(xiàn)肝硬化

7、、增生結(jié)節(jié)、灶狀變性，同時癌周出現(xiàn)包裹性的囊腫。提示虎眼萬年青總皂苷以癌周出現(xiàn)囊腫阻斷癌灶血液供應(yīng)而起到抑制肝癌發(fā)展。
　　肝癌前病變階段（14周）時線粒體部分空泡化、出現(xiàn)脂滴、嵴部分斷裂、腫脹、變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。而虎眼萬年青總皂苷作用的預(yù)防組僅部分出現(xiàn)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)復(fù)合體。且虎眼萬年青總皂苷作用的治療組線粒體部分空泡化、出現(xiàn)脂滴、嵴部分斷裂，尚未出現(xiàn)線粒體變形及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張現(xiàn)象。在癌變進展階段（18周）模型組肝癌細胞核碎裂、染色質(zhì)

8、邊集，細胞漿不均，線粒體固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、部分脫顆粒，癌旁細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生活躍；化療組癌細胞線粒體輕度腫脹、空泡化、脂滴、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核膜變形、染色質(zhì)分布不均，而癌旁細胞中溶酶體增多；而虎眼萬年青總皂苷治療組癌細胞線粒體腫脹、空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張伴網(wǎng)池中大量顆粒，細胞漿疏松，出現(xiàn)大量溶酶體。
　　全文第四部分運用免疫組化方法，動態(tài)檢測肝組織標(biāo)本的Ki67、Flt-1的表達，并以虎眼萬年青總皂苷干預(yù)。發(fā)現(xiàn)模型組、給藥組大鼠肝

9、組織Ki67指數(shù)（LI）升高明顯，并與正常組有統(tǒng)計學(xué)差異。肝癌變過程中以12周Ki67LI最高，說明此階段肝細胞增生活躍，而虎眼萬年青總皂苷干預(yù)此階段的肝細胞增生。至14周及18周模型組Ki67 LI逐漸降低，與12周模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與二乙基亞硝胺誘發(fā)的肝癌以高分化為主有關(guān)。虎眼萬年青總皂苷并不明顯干預(yù)14周及18周肝細胞增生，Ki67 LI與大鼠模型組統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異。模型組、給藥組均出現(xiàn)Flt-1指數(shù)（LI）增高，與

10、正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。誘癌14周模型組Flt-1 LI表達最高，虎眼萬年青總皂苷作用的14周預(yù)防組、治療組Flt-1 LI降低，且與模型組有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組12周、18周FI相對低下，與14周模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。而在12周、18周虎眼萬年青總皂苷作用組與相應(yīng)模型組間無統(tǒng)計學(xué)意義。這說明肝癌誘發(fā)過程中以促進期（14周）Flt-1表達較高，虎眼萬年青總皂苷在此期干預(yù)Flt-1表達，防止肝癌的進一步發(fā)展。
　　全文第五部分運用實

11、時定量PCR檢測肝癌變過程中肝組織、肝癌組織、癌旁組織胰島素樣生長因子-II（IGF-Ⅱ）和p16ink4a水平。結(jié)果顯示癌變前期肝組織中IGF-Ⅱ含量增加并不明顯，肝癌進展階段肝癌組織中IGF-Ⅱ表達陽性率明顯高于癌前期肝組織；虎眼萬年青總皂苷在肝癌前期作用不大，而至肝癌進展階段，虎眼萬年青總皂苷治療的肝癌組織IGF-Ⅱ表達量明顯低于模型組的肝癌組織。說明IGF-Ⅱ可能主要是通過肝細胞癌自分泌方式表達其水平，而虎眼萬年青總皂苷治療組抑