甘藍(lán)型油菜brassicanapusl.油酸含量遺傳和應(yīng)用ihprna沉默fad2基因研究

1、摘要甘藍(lán)型油菜( B r a s s i c a n a p u sL ．) 油酸含量遺傳和應(yīng)用i h p R N A 沉默丘d 2 基因研究摘要油酸是油菜籽油脂肪酸的重要組成成分，油酸含量的多少影響油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如何提高油菜籽油中油酸的含量是眾多學(xué)者關(guān)心的問題．本研究應(yīng)用植物數(shù)量性狀主基因+ 多基因的多世代聯(lián)合分析方法研究油酸含量的遺傳；并且應(yīng)用f h p R N k誘導(dǎo)基因( f a d 2 ) 沉默途徑培育高油酸含量轉(zhuǎn)基

2、因材料．主要結(jié)果如下：1 對(duì)甘藍(lán)型油菜雜交組合8 0 8 7 ×8 1 0 8 的P l ，P 2 ，F(xiàn) 1 ．B l 、B 2 和F 2 等6 個(gè)世代種子油酸舍量主基因+ 多基因遺傳分析結(jié)果表明：( 1 ) 該組合油酸含量受2 對(duì)加性．顯性．上位性主基因+ 加性．顯性．上位性多基因控制遺傳；( 2 ) 該雜交組舍的B 1 ，B 2 和F 2群體油酸含量主基因遺傳率為4 3 ．8 3 ％一9 4 ．7 1 ％，多基因遺傳率為0

3、 ．6 5 ％一3 0 。8 5 ％，表明該組合油酸含量是由2 對(duì)主基因+ 多基因共同控制的，并以主基因遺傳為主；( 3 )油酸含量以加性效應(yīng)和上位性效應(yīng)為主，顯性效應(yīng)比較?。? ．構(gòu)建了具有種子特異性表達(dá)的向犯基因的—妒m q A 表達(dá)栽體p C N F I R n o $ ．通過P C R 擴(kuò)增分離到甘藍(lán)型油菜種子特異性表達(dá)的N a p i n 啟動(dòng)子的序列( 1 1 4 7 b p ) 以及油酸脫飽和酶基因餉以) 的一個(gè)5 3 T

4、 o p 的片段，并將其分別克隆到p G E M - T e a s y 裁體中．為構(gòu)建油菜種子特異性表達(dá)歸以基因的啦，R N A 植物表達(dá)載體，首先將f a d 2 基因片段以正向的方式連接在一個(gè)可剪切的內(nèi)含子的5 ’末端，而以反向的方式連接到該內(nèi)舍子的3 ’末端，構(gòu)建扛龍基因的反向重復(fù)框；然后將N a p i n 啟動(dòng)子序列連接到該反向重復(fù)框的5 ’端，而在其3 ’端接有一個(gè)n o $ 終止子序列；最后將f a d 2 基因的反向重

5、復(fù)表達(dá)框分兩步克隆到植物雙元栽體p C A M B I A 2 3 0 0 的p u c l 8 多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了l a d 2 基因的卻R N A 表達(dá)栽體p C N F [ R n o s ．3 建立了油菜農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，并獲得轉(zhuǎn)基因植株．用甘藍(lán)型油菜寧油1 2號(hào)下胚軸和帶柄子葉為外植體進(jìn)行豇以基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究，結(jié)果表明：( 1 ) 寧油1 2 號(hào)下胚軸最適分化培養(yǎng)基為：M S + I ．5 m g J L 6 一B A +

6、 0 ．1 5m g m N A A + O ．0 1 m g ／LG A 3+ 0 ．5 9 ／L M e s + 0 ．5 9 m P V P + 4 0 m g ／L A d + 3 ．5 m g ／L A g N 0 3 ，其再生頻率和分化頻率分別為2 5 ．7 1 ％和3 L 4 3 ％；( 2 ) 寧油1 2 號(hào)下胚軸和子葉柄經(jīng)過l m g m 2 ，4 ．D 預(yù)培養(yǎng)，能明顯提高芽分化率；( 3 ) 隨著A g N 0 3

7、濃度的增加，芽苗再生頻率和分化頻率逐漸提高；3 ．5 m g ／L A g N 0 3 是寧油1 2 號(hào)下胚軸芽苗高頻率再生的最適濃度；( 4 ) 隨著卡那霉素濃度增加，寧油1 2 號(hào)下胚軸和子葉柄不定芽分化頻率逐漸降低；2 0 m # L 卡那霉素作為篩選轉(zhuǎn)化芽的最適濃度；( 5 ) 抑制農(nóng)桿菌過度生長(zhǎng)的羧芐青霉素的適宜濃度為摘要S T U D I E S O N I N H E R I r I ：f 蝌C E A N D I M P

8、 R O V E M E N To F o L E I C A C I D C O N T E N T 、1 A 刀刃，l t N AS I L E N C I N G E 4 D 2 G E N E I NB l 翻S S 五翻A H P 【，S L ．A B S T R A C TO i e i ca c i di s a ni m p o r t a n t f a t t ya c i dc o m p o s i t i o

9、no fr a p e s e e do i l ．T h en u t r i t i o n a la n de c o n o m i cv a l u e o f r a p e s e e do i l i sd e t e r m i n e db yc o n t e n to f o l e i ca c i di n t h eo i l ．H o wt oi m p r o v e o l e i c a c i d

10、c o n t e n ti nm p e s c e d o i li so n e o f t h ei m p o r t a n t b r e e d i n gg o a l si no i l s e e dr a p eb r e e d i n gp r o g r a m ．H i g h o l e i c a c i d m a t e r i a lh a d b e e no b t a i n e dt l

11、 t r o u g l aE M S c h e m i c a lm u t a g e n e s i s a n dR N A i g e n es i l e n c i n g t e c h n o l o g ya sw e l la st r a d i t i o n a l b r e e d i n gm e t h o d s ．T h e i n h e r i t a n c eo f o l e i ca

12、 c i dc o n t e n tw a s s t u d i e di nt h i sr e s e a r c hb ya p p l y i n gm a j o r g e n ep l u sp o l y g e n em i x e dg e n e t i cm o d e l sa n dj o i n ta n a l y s i sm e t h o do fm u l t i - g e n e r a

13、t i o n ．A n ds o m e t r a n s g e n i cp l a n t sw i t h f a r 2g e n eW e r ec r e a t e db yR N A ig e n es i l e n c i n gt e c h n o l o g y ．T h e m a i n r e s u l t s f r o m t h i sr e s e a r c h w e r e a sf

14、 o l l o w s ：1 ．I n h e r i t a n c e o fo l e i c a c i d c o n t e n t ( O A C ) W a si n v e s t i g a t e d i n P 1 ，P 2 ，F(xiàn) l ，B I ，B e a n d F 2g e n e r a t i o n sd e r i v e df r o mt h ec r O S S o f8 0 8 7 x 8

15、 1 0 8 ( B r a s s i c an a p u s L 1 ．R e s u l t ss h o w e d t h a t ：O ) O A C w e r e c o n t r o l l e db y t w om a j o r g e n e s w i t ha d d i t i v e - d o m i n a n c e - e p i s l a t i c e f f e c t s p l

16、u sp o l y g e n e s w i t h a d d i t i v e ·d o m i n a n c e —e p i s t a t i ce f f e c t s ( t h e E ·0m o d e l ) ．( 2 ) H e r i t a b i l i t yv a l u e so f t h e m a j o r g e n e s ( h 2 m 0o fB 1 、1

17、3 2 a n d F 2 p o p u l a t i o n W a se s t i m a t e d a s4 3 ．8 3 ％．9 4 ．0 6 ％a n d9 4 ．7 1 ％r c s p e c I i V c l y ' w h i l ct h o s e o f p o l y g e n e s ( h 2 0 W a s o ．6 5 ％，0 ．8 6 ％a n d 3 0 ．8 5 ％．I td

18、e m o n s -t r a t e dt h a tO A C l e v e li nt h e g r o s s w a sc o n t r o l l e db yt w o m a j o r g e n e sm i x e d w i t ht h ee f f e c to fp o l y g e n e s , b u tm a i n l y g o v e r n e db yt w om a j o r

19、g e n e s ．( 3 ) A d d i t i v ee f f e c t s a n de p i s t a t i ce f f e c t s c o n t r i b u t e dl a r g e l yt oO A C , w h i l e d o m i n a n c e e f f e c t s W a sr e l a t i v e l ys m a l l e r ．2 ．T h e f u

20、 l l - l e n g t h s e q u e n c e ( 1 1 4 7 b p ) o fn a p ／n p r o m o t e ra n dac o n , s c w e dr e g i o n( 5 3 7 b p ) o fm i e r o s o m a lA ) 2 - d e s a t u r a s eg e n e 伽d 2 ) w e r ea m p l i f i e df r o

21、mR n a p u sL a n dc l o n e di n t o t h e p G E M - Te a s y v e c t o r ．T o d e v e l o pas e e d ·s p e c i f i c e x p r e s s i o n f h p R N At a r g e t e dt h e ／a d 2g e n e i n 丑n a p u s L ．a(chǎn) ni n v e r

22、 t e dr e p e a t e d u n i to f t h e5 3 T o p s e g r a e n t o f t h e丘d 2 g e n eW a sf i r s t c l o n e d i n t o am e d i u mv e c t o r , t h ep H u r r i c a nV e c t o r , i n t e r r u p t e db yas p l i c e a

23、 b l e f a d 2i n t r o ns e q u e n c e ．T h e nt h es e e d —s p e c i f i cp r o m o t e r , n a p i n p r o m o t e r , w a sp l a c e dt ot h e5 ·e n do f t h ei n v e nr e p e a tc a s s e t t e ，a n dn ／'