假性甲狀旁腺功能減退家系致病位點(diǎn)篩查及gnas基因c.952tc對(duì)gas功能的影響

1、摘要目的：假性甲狀旁腺功能減退I a 型( P H P I a ) 是由G N A S 基因突變引起。門診發(fā)現(xiàn)矮胖圓臉、指趾骨粗短病人、血P 1 ’H 水平升高病人，為明確病人診斷進(jìn)一步行生化檢查、基因突變篩查；體外突變體構(gòu)建明確突變對(duì)G a s 功能的影響。方法：對(duì)患者及其家屬進(jìn)行甲狀旁腺素、促甲狀腺激素，促性腺激素，雌二醇及血鈣磷等檢測(cè)。用1 3 對(duì)引物對(duì)病人及其家系G N A S 基因進(jìn)行外顯子及外顯子內(nèi)含子交界區(qū)擴(kuò)增與測(cè)序，發(fā)現(xiàn)

2、G N A SC ．9 5 2 T > C 。購買腎臟c D N A ，用分別帶有X h oI 和H i n d l n 的上下游引物擴(kuò)增G s ac D N A ，產(chǎn)物純化酶切后，與用Xh 0I 和H i n d I I I 酶切后的P c D N A 3 ．1 ( 一) 用連接酶連接，構(gòu)建G N A S - - p c D N A 3 ．1 野生型載體，定點(diǎn)突變獲得G N A S c ．9 5 2T > C - - P

3、c D N A 3 ．1 載體，測(cè)序證實(shí)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并搖菌2 0 0m l ，用Q I A G E N 質(zhì)粒大抽試劑盒抽提質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染0 K 細(xì)胞，培養(yǎng)48 小時(shí)，用P r o m e g ac A M P 檢測(cè)試劑盒對(duì)野生型、突變型及空載轉(zhuǎn)染的O K 細(xì)胞進(jìn)行空白及P T H 刺激狀態(tài)下的c A m P 檢測(cè)，觀察突變對(duì)功能的影響。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3 次。同源建模初步探討該突變引起G s a 功能改變的可能機(jī)制。結(jié)果：( 1

4、 ) 生化及激素結(jié)果提示：患者存在多激素抵抗體，其家屬正常；( 2 ) 基因測(cè)序結(jié)果顯示患者及其母親存在G N A S 基因C ．9 5 2T > C 突變；( 3 ) 載體構(gòu)建測(cè)序結(jié)果顯示載體構(gòu)建成功，野生型與突變型僅存在c ．9 5 2T > C 的差異；( 4 ) cA M P 檢測(cè)結(jié)果提示：突變型cA M P 水平較野生型明顯下降( PC 引起，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該突變可以引起G a s 功能下降，而該功能下降可能是由于G

5、 s a 與G sBY 相互作用障礙引起。關(guān)鍵詞：假性甲狀旁腺功能減退；G N A S 基因：A H O 體征錄弓I 言????????????????????????????????????譬????．1第一章病人情況描述與G N A S 基因檢測(cè)????????????????2第一節(jié)病人基本情況及激素檢測(cè)???????????????????2第二節(jié)G N A S 基因檢測(cè)???????????????????????．3第二章生

6、物信息技術(shù)的應(yīng)用???¨?????????????????6第一節(jié)G N A S 基因保守性分析????????????????????·6第二節(jié)同源建模及功能預(yù)測(cè)????????????????????“6第三章G a s 野生型與突變型功能檢測(cè)?????????????????7第一節(jié)載體構(gòu)建??????????????????????????7第二節(jié)O K 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及c A M P 檢測(cè)????????????

7、??????”1 3第四章討論???????????????????????????1 7結(jié)論????????????????????????????????????????．19參考文獻(xiàn)????????????????????????????·2 0綜述????????????????????????????????????????·2 3攻讀學(xué)位期間的研究成果??????????????????????3 l附錄