分子診斷學(xué)第四章核酸與蛋白質(zhì)的分離與純化

1、,第四章 核酸與蛋白質(zhì)的分離與純化,課程要求,分離純化的核酸與蛋白質(zhì)的注意事項,熟悉,本章課程內(nèi)容,核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，具有生物催化、物質(zhì)運輸、運動、防 御、調(diào)控等多種生理功能。得到高度純化同時具有生物活性的目的物質(zhì)是研究核酸和蛋白質(zhì)的 關(guān)鍵問題。,從分子水平上認識生命的現(xiàn)象已經(jīng)成為現(xiàn)代生物科學(xué)發(fā)展的主要方向，核酸和蛋白質(zhì)作為體內(nèi)最重要的生物大分子，是生命體結(jié)構(gòu)和

2、功能的重要基礎(chǔ)。,,因此，核酸及蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)起到?jīng)Q定性作用。,前言,核酸分離與純化的基本原則,核酸分離與純化的技術(shù)路線,,核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3’, 5’—磷酸二酯鍵連接成的一類生物大分子，包括核糖核酸RNA和脫氧核糖核酸DNA兩類。,,,,,,真核生物,核酸簡介,,,,核酸分離與純化的基本原則,主要技術(shù)路線,,機械法不適合真核基因組DNA，非機械法中溶胞法應(yīng)用最廣泛,核酸分離純化的第一步就是裂解細胞，釋放核酸。,核酸

3、的釋放,1,分離純化步驟多，核酸純度高但得率低；分離純化步驟簡化，得率高純度低。,復(fù)雜的混合物中純化核酸時，清除的主要雜質(zhì)包括三部分：,核酸的分離與純化,2,（1）核酸的濃縮,①固體聚乙二醇（PEG）濃縮將DNA溶液裝入透析袋，包埋于PEG使DNA脫水。,核酸濃縮常選用有機溶劑沉淀法,②丁醇抽提濃縮正丁醇或仲丁醇具有吸水能力，但DNA不溶于丁醇，振蕩混合后離心，去除有機相，可顯著減少DNA體積。,核酸的濃縮、沉淀與洗滌,3,沉淀的特

4、點1.易將核酸溶液調(diào)至所需濃度2.改變?nèi)芙夂怂岬木彌_液種類3.去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子,沉淀是濃縮核酸最常用且高效的方法。,可選擇有機溶劑沉淀核酸加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后可用有機溶劑（如乙醇、異丙醇等）沉淀核酸，少量共沉淀的鹽，可使用70~75%的乙醇洗滌。,（2）核酸的沉淀與洗滌,(A值等于1時，相當于50μg/ml雙鏈DNA， 40μg/ml單鏈DNA或RNA，33μg/ml單鏈寡核苷酸）,（1）紫外分光光度法

5、測定DNA在A260nm的光吸收值,只用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液,島津紫外可見分光光度計系列,如計算DNA濃度,核酸的鑒定-濃度鑒定,4,原理：熒光染料溴化乙錠（EB），可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。,特點：適用于低濃度核酸溶液的定量分析,高靈敏度：1-5 ng，但具有強致癌性,（2）熒光光度法,熒光光度法,（1）紫外分光光度法 A260 /A280 的比值來判定有無蛋白質(zhì)污

6、染和鑒定核酸純度的重要指標。 純的DNA A260與A280之比應(yīng)在1.8 純的RNA A260與A280之比應(yīng)在2.0,（2）熒光光度法 用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果進行評定。,核酸的鑒定-純度鑒定,4,核酸凝膠電泳法：以溴化乙錠為示蹤劑，結(jié)果可判定核酸制品的完整性。,；,總RNA電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。,基因組DNA電泳，在電場中泳動慢

7、，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象,核酸的鑒定-完整性鑒定,4,核酸的保存,5,基因組DNA的分離與純化,質(zhì)粒DNA的分離與純化,DNA片段的回收,基因組DNA的分離與純化,質(zhì)粒DNA的分離與純化,DNA片段的回收,,真核生物染色體DNA潛在反應(yīng)基團隱藏在螺旋內(nèi)部，由于堿基對外側(cè)受磷酸和戊糖的保護，并且內(nèi)部堿基堆積力的作用進一步加強。,真核生物DNA具有強化學(xué)耐受性,核內(nèi)染色體DNA，惰性很強的分子,大于150kb的DNA分子多數(shù)

8、易被切斷,高分子量的DNA在物理上易被破壞。溶液中形態(tài)：長而彎曲的形態(tài)，易卷曲，黏滯。易受到吸液、振蕩、攪拌等引起的剪切作用而斷裂,相對分子質(zhì)量大的哺乳動物DNA, 對機械剪切力敏感,提純時難保證完整性相對分子質(zhì)量小的噬菌體DNA，采用常規(guī)方法不會造成其DNA 的斷裂,DNA易以片段形式被分離,,真核細胞基因組DNA分離純化一般路線,2,提取注意事項,盡量避免DNA斷裂和降解提取方法： 1、溫和裂解細胞并溶解DNA，使D

9、NA與組蛋白分離，并完整地以可溶形式分離出來。 2、采用酶學(xué)或化學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、RNA及其他大分子。,細胞的破碎,3,真核細胞基因組DNA分離純化主要方法有：酚抽取法，甲酰胺解聚法，玻璃棒纏繞法，各種快速方法等。,不同哺乳動物基因組DNA提取方法比較,真核細胞基因組DNA分離純化方法,4,視頻,本法最初于1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立,EDTA和SDS存在下，蛋白酶K破碎細胞，消化蛋白,PH8.0的Tris飽和酚

10、或酚-氯仿抽提DNA,乙醇或異丙醇進行沉淀,改良方法,獲得DNA大小100-150kb,,,（1）酚抽提法,基因組DNA的分離與純化,,,酚抽提法制備基因組DNA流程圖,基因組DNA的分離與純化,主要試劑的作用,,酚抽提法可以從單層或懸浮培養(yǎng)細胞、新鮮組織及血液標本中制備少于10ug大到數(shù)百ug的DNA樣品。,,溫和盡量減少酚-氯仿抽提次數(shù)混合時要溫和盡量保證DNA完整性,兩個原則 防止DNase對DNA的降解減少對DNA的

11、機械破壞,注意事項,方法：破碎細胞方法同酚抽提法，用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合，再透析獲得DNA，分子量一般大于200kb,方法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液饒于玻棒，生成DNA約80kb。,應(yīng)用：適用于構(gòu)建高容量載體的DNA文庫和進行分子質(zhì)量巨大的DNA片段的脈沖場凝膠電泳,應(yīng)用：適用于Southern印跡雜交和PCR反應(yīng)。,（2）甲酰胺解聚法,（3）玻璃棒纏繞法,包括細

12、菌、支原體、衣原體、立克次體、放線菌和藍綠藻等,是最簡單的細胞生物體。病原微生物引起感染性疾病感染性疾病診斷復(fù)雜,原核生物種類,分子較大（細菌DNA可達2×109bp），易受機械剪切力破壞細菌種類比病毒復(fù)雜破壁比較困難,原核生物DNA制備困難,分離步驟,常用方法學(xué)及評價,得完整DNA,首先要純化病毒粒子：1.SDS或酚處理或兩者結(jié)合處理2.避免劇烈振蕩及攪拌防止DNA切斷，使用寬口吸管吸取DNA溶液,病毒粒子的純

13、化,病毒核酸提?。篠DS-酚法,基因組DNA的分離與純化,質(zhì)粒DNA的分離與純化,DNA片段的回收,質(zhì)粒是細菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復(fù)制和穩(wěn)定遺傳的共價閉合環(huán)DNA分子。,,質(zhì)粒DNA的分離與純化,質(zhì)粒DNA提取基本大致過程,,質(zhì)粒DNA的分離與純化,原理：在NaOH提供的強堿性（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細胞膜使細胞裂解，釋放出細胞內(nèi)DNA及蛋白質(zhì)。簡單、重復(fù)性好而且成本低，是使用最廣泛的方法。,堿裂解法流程圖,

14、（1）堿裂解法,,質(zhì)粒DNA的分離與純化,原理利用溶菌酶和TritonX-100破壞細胞壁，再用沸水浴裂解細胞，并使宿主細胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。,應(yīng)用該法劇烈，只用于提取相對分子質(zhì)量小(＜15kb)的質(zhì)粒DNA， 1.適用于大多數(shù)E.coli菌株, 2.不適宜會釋放出大量糖類的菌株及表達核酸內(nèi)切酶EndA的菌株。,（2）煮沸裂解法,加熱：使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性 降溫：質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體DNA不能復(fù)性

15、,,質(zhì)粒DNA的分離與純化,SDS裂解法流程圖(以動物組織為例）,裂解較溫和,常用的抽提方法將細菌懸浮在等滲的蔗糖溶液中 以溶菌酶和EDTA裂解，酚-氯仿抽提適合相對分子質(zhì)量大(＞15kb)的質(zhì)粒 DNA的抽提，但產(chǎn)率不高,（3）SDS裂解法,,質(zhì)粒DNA的分離與純化,純化質(zhì)粒DNA的常用方法,,質(zhì)粒DNA的分離與純化,①氯化銫-溴化乙錠密度梯度平衡離心法（CsCl-EB法）,特點容量大、分辨率高、純化效果好，純

16、化的首選方法。費時，設(shè)備與試劑昂貴。,原理細菌裂解液+氯化銫+溴化乙錠（EB）1.蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層 2.RNA密度最大沉于管底 3.DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的DNA與EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開。,,,質(zhì)粒DNA的分離與純化,②聚乙二醇沉淀法,聚乙二醇沉淀：是一種分級沉淀簡單、經(jīng)濟、適用廣，適用于分子克隆中所有常規(guī)的酶學(xué)反應(yīng)及哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染。,特點,沉淀

17、原理示意圖,,質(zhì)粒DNA的分離與純化,③柱層析法,純化關(guān)鍵是用于填充層析柱的樹脂。樹脂分類：疏水的相互作用 離子交換與吸附的相互作用原理,柱層析法純化細菌質(zhì)粒DNA,1.高鹽下，DNA與硅基質(zhì)可逆性的結(jié)合進行純化。2.高鹽造成磷酸二酯骨架脫水，暴露的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，然后用50%的乙醇洗去RNA和糖類物質(zhì)，再加入TE或水，離心洗脫。,,,質(zhì)粒DNA的分離與純化,純化常用方法比較,基因組DNA的分離與

18、純化,質(zhì)粒DNA的分離與純化,DNA片段的回收,DNA回收基本流程,,DNA片段的回收,DNA片段回收的原則,,DNA片段的回收,每種回收方法有其適用范圍，應(yīng)根據(jù)不同要求精選不同方法。,,DNA片段的回收,聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段的標準方法是碾碎浸泡法。,RNA制備條件與環(huán)境,總RNA的分離與純化,mRNA的分離與純化,RNA制備條件與環(huán)境,總RNA的分離與純化,mRNA的分離與純化,,RNA制備條件與環(huán)境,排除RNase的污染且

19、抑制其活性是純化成功與否的關(guān)鍵。1.避免細胞外RNase的污染并抑制其活性2.抑制細胞內(nèi)RNase的活性并去除RNase。,一般原則,環(huán)境,RNA制備條件與環(huán)境,總RNA的分離與純化,mRNA的分離與純化,,總RNA的分離與純化,,分離與純化過程中使用的試劑與其用途,1總RNA提取法中最常使用的方法。2.以異丙醇沉淀RNA，可選擇性地沉淀大分子rRNA和mRNA，故提取的總RNA中rRNA和mRNA比例高，小分子量RNA較少,,總

20、RNA的分離與純化,,,一步法,視頻,特點 ：簡便、經(jīng)濟和高效，RNA提取質(zhì)量高，且高完整性與純度。,,總RNA的分離與純化,經(jīng)典的一步法，由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。,（1）異硫氰酸胍-酚氯仿一步法,以（異）硫氰酸胍-酚為裂解液，再加入氯仿形成兩相，變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相之間，上層RNA溶液，最后異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌。,,總RNA的分離與純化,（2）商品化的單相裂解試劑法—改良方法,（3）其

21、它方法,(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法鹽酸胍-有機溶劑法LiCl-尿素法熱酚法,RNA制備條件與環(huán)境,總RNA的分離與純化,mRNA的分離與純化,Poly(A+)：絕大多數(shù)mRNA在其3‘末端帶有一個長短不一的poly(A)尾巴起始材料：總RNA樣品,,mRNA的分離與純化,方法：oligo(dT)-纖維素或poly(U)-瓊脂糖凝膠的親和層析利用核酸的堿基配對原理，同時分離不同種類與大小的mRNA的分子群體,,mRNA的

22、分離與純化,mRNA制備的一個標準方法。,1.oligo(dT)-纖維素柱層析法,,,mRNA的分離與純化,,mRNA的分離與純化,2.oligo(dT)-纖維素柱離心法,適用情況制備的mRNA可用于Northern雜交、RT-PCR及體外翻譯。,優(yōu)點克服了oligo(dT)-纖維素層析柱法流速慢、易堵塞等不足 通過一系列可離心的分離層析柱，達到快速制備的目的。多個樣品的批量處理，具有快速、產(chǎn)量高及質(zhì)量好等優(yōu)點,原理：不

23、用填柱,,mRNA的分離與純化,3.oligo(dT)-纖維素液相結(jié)合離心法,優(yōu)點：可同時批量處理多個樣品，能從少量的RNA樣品中分離出poly(A)+RNA,離心,收集,70%的乙醇洗脫,沉淀,原理利用oligo(dT)與poly(A)的互補配對特性、生物素與鏈親和素的特異性結(jié)合和磁性分離。,,mRNA的分離與純化,4.磁性球珠分離法,磁性球珠分離法mRNA原理,特點產(chǎn)量提高,回收率高70%~100%,純度高，缺點細胞和組織的

24、處理量不超過1g，磁珠價格貴,適用情況能用于幾乎所有的分子生物學(xué)實驗,,,mRNA的分離與純化,5.其他方法,poly（U）-濾紙法在共價交聯(lián)有poly（U）的濾紙上點樣總RNA,再經(jīng)洗滌后加熱洗脫poly(U)-凝膠層析法Poly（U）-凝膠層析法利用poly（U）與poly(A)的互補配對原理。,蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則,原材料的準備與處理,蛋白質(zhì)的精制純化,蛋白質(zhì)的粗制分離,蛋白質(zhì)純化后處理,蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則

25、,原材料的準備與處理,蛋白質(zhì)的精制純化,蛋白質(zhì)的粗制分離,蛋白質(zhì)純化后處理,,蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則,不同蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)由氨基酸殘基的種類、數(shù)目和序列決定。,蛋白質(zhì)分離純化主要的技術(shù)和方法如下表所示：,,蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則,,蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則,蛋白質(zhì)分離與純化基本流程,蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則,原材料的準備與處理,蛋白質(zhì)的精制純化,蛋白質(zhì)的粗制分離,蛋白質(zhì)純化后處理,,富含所要純化的蛋白質(zhì)并易于處理的材料。,1

26、.不同生物材料選用不同破碎方法：2.常用的破碎方法有機械法，物理法 化學(xué)法，裂解法，酶解法等。,原材料的準備及處理,原材料選擇原則,預(yù)處理-破碎組織或細胞,,①超聲破碎法②滲透壓法③凍融法,①高速組織搗碎法②人工研磨法③高壓擠壓法④玻璃勻漿器勻漿法,,原材料的準備及處理,①溶劑處理法②去污劑處理法,①自溶法②酶解法,1.機械法,2.物理法,3.化學(xué)法,4.酶解法,5.裂解法通過使用裂解液使細胞裂解，常用的比較如下

27、表所示,,原材料的準備及處理,蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則,原材料的準備與處理,蛋白質(zhì)的精制純化,蛋白質(zhì)的粗制分離,蛋白質(zhì)純化后處理,目的：將目標蛋白質(zhì)與細胞中其他物質(zhì)分離，由固相轉(zhuǎn)入液相，或從細胞內(nèi)的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入到外界特定的溶液中。,,蛋白質(zhì)的粗制分離,定義：將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細胞置于特定溶劑，使待純化的蛋白質(zhì)充分釋放到溶劑中，并盡量保持其原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性的過程。,方法：根據(jù)蛋白質(zhì)可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液及有機溶

28、劑作為依據(jù)。,（1）水溶液提取分離法,,蛋白質(zhì)的粗制分離,②溫度：在一定溫度范圍內(nèi)(0～40℃之間)，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加,①鹽析法：最經(jīng)典的方法，常用來進行粗分離，常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等，其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨,③等電點法：當?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點pH時，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于凝集和沉淀，它的溶解度達到最低 。,和脂質(zhì)結(jié)合牢固/分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)

29、由于親水性和較強的親脂性,可用有機溶劑如乙醇、丙酮、丁醇等,,蛋白質(zhì)的粗制分離,（2）有機溶劑提取法,蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則,原材料的準備與處理,蛋白質(zhì)的精制純化,蛋白質(zhì)的粗制分離,蛋白質(zhì)純化后處理,通過蛋白質(zhì)粗制分離，體積較大的雜質(zhì)大部分已被除去，在此基礎(chǔ)之上，進一步對含有的目標蛋白質(zhì)樣品進行純化。,,蛋白質(zhì)的精制純化,常用方法：柱層析法、梯度離心法、電泳法最常用方法為柱層析法，后幾種方法常用作最后的精制純化過程,特點：簡便、

30、處理量大，提高分辨率、濃縮蛋白質(zhì)溶液 但分離規(guī)模較小,了解需要純化的蛋白質(zhì)的分子量、等電點、溶解性及穩(wěn)定性等基本性質(zhì)，而選擇合適的層析方法、層析介質(zhì)、加樣、洗滌與洗脫條件,一般層析技術(shù)選擇如下：,,蛋白質(zhì)的精制純化,層析技術(shù)的選擇,視頻,,蛋白質(zhì)的精制純化,（1）親和層析,親和層析的基本過程,特點：特異性好，選擇性高，但具有局限性,原理利用生物大分子與其特異性配基的專一性識別和可逆性結(jié)合而建立起來的分離方法。,

31、應(yīng)用生物特異性親和層析：免疫親和層析,凝集素親和層析人工配體親和層析,,蛋白質(zhì)的精制純化,依據(jù)蛋白質(zhì)具有等電點溶液pH值=等電點，蛋靜電荷為=0，溶液ph值>等電點，蛋白質(zhì)帶負電荷，溶液ph值<等電點，蛋白質(zhì)帶正電荷,（2）離子交換層析,離子交換層析分離原理示意圖,影響因素PH值，交換基團類型，鹽濃度，上樣量，柱的塔板數(shù)，洗脫梯度和流速,常用離子交換劑纖維素離子交換劑，交聯(lián)聚糖離子交換劑，瓊脂糖離子交換劑,,

32、,蛋白質(zhì)的精制純化,電泳法的選擇,原理在電場作用下,帶電顆粒向著與其電性相反的電極方向移動的現(xiàn)象。,常用電泳類型包括區(qū)帶電泳，等電聚焦電泳及雙向凝膠電泳,,蛋白質(zhì)的精制純化,（1）等電聚焦,原理利用具有不同等電點（pI）的蛋白質(zhì)在線性pH梯度下泳動（蛋白質(zhì)所處的pH<pI時，向著負極移動，反之則向正極移動），并聚焦于與其pI值相同的pH位置，達到蛋白質(zhì)混合物分離的方法。,常用電泳膠固相pH梯度干膠條（IPG）,應(yīng)用常聯(lián)用

33、其他電泳，如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)及毛細管電泳,,蛋白質(zhì)的精制純化,（2）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法,SDS和還原劑(巰基乙醇,二硫蘇糖醇DTT)的作用分子被解聚或組成它們的多肽鍵氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。,,蛋白質(zhì)的精制純化,（3）雙向凝膠電泳(2-DE)

34、,目前最有效 , 分辨率最高的蛋白質(zhì)電泳手段,雙向凝膠電泳=等電聚焦電泳+SDS-PAGE電泳,雙向凝膠電泳示意圖,蛋白質(zhì)分離與純化的基本原則,原材料的準備與處理,蛋白質(zhì)的精制純化,蛋白質(zhì)的粗制分離,蛋白質(zhì)純化后處理,指除去純化手段提純的蛋白質(zhì)溶液中常常含有的多余的鹽離子濃 度的過程。脫鹽的主要方法有三種，即透析法、超濾法、凝膠過濾法。,,蛋白質(zhì)的純化后處理,1.脫鹽,脫鹽、濃縮、干燥和保存,,蛋白質(zhì)的純化后處理,低濃度溶液通過去

35、除溶劑變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^程.,常用的濃縮方法,2.濃縮,超濾法減壓濃縮法：真空度，液體沸點有關(guān)吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝膠等沉淀法：硫酸銨沉淀法，聚乙二醇沉淀，免疫沉淀法，有機溶劑沉淀,真空干燥 ：其原理與減壓濃縮相同，真空度愈高，溶液沸點愈低，蒸發(fā)愈快。通常適用于不耐高溫、易氧化物質(zhì)的干燥和保存。,,蛋白質(zhì)的純化后處理,3.干燥,蛋白質(zhì)通過制備得到所需的產(chǎn)品后，為了防止變質(zhì)、保持生物活性、易于保存和運輸，常常需要干

36、燥處理,冷凍真空干燥：在真空干燥原理的基礎(chǔ)之上增加溫度因素。適用于各類蛋白質(zhì)的干燥保存。,常用的干燥方法,,蛋白質(zhì)的純化后處理,4.樣品的保存,保存方法與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及保持生物活性有很大關(guān)系,常用的保存方法,干粉保存：干燥的蛋白質(zhì)制品一般比較穩(wěn)定，貯藏方法簡單，只需將干燥后的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，在0～4℃冰箱中保存即可。,液態(tài)保存：只在特殊情況下采用，并有嚴格的防腐保護措施（如防腐劑、穩(wěn)定劑），保存時間不宜過長。大多

37、數(shù)生物活性物質(zhì)液態(tài)保存時，在0～4℃冰箱中保存即可。,從近年核酸和蛋白質(zhì)前沿研究的發(fā)展方向來看，組織、細胞的分離純化所得的目的物質(zhì)，有助于從分子水平了解生命活動的規(guī)律及揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)。高純度的目的物質(zhì)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療保健、基因因工程等方面，如食品、發(fā)酵等的高活性酶制劑、豬胰島素治療糖尿病，轉(zhuǎn)基因動、植物等。,,小結(jié),,以精制分離純化蛋白質(zhì)和核酸為核心技術(shù)對指導(dǎo)工、農(nóng)，醫(yī)等方面的發(fā)展具有重大意義。,,思考題,1.試講述基因組DNA

38、與質(zhì)粒DNA分離與純化的異同點。,2.制備RNA的過程中應(yīng)該注意哪些問題？,3.常用蛋白質(zhì)精制純化的方法有哪些？請舉例說明其應(yīng)用。,,問題,,思考題,1.試講述基因組DNA與質(zhì)粒DNA分離與純化的異同點。,,思考題,2.制備RNA的過程中應(yīng)該注意哪些問題？,獲得完整的RNA分子的關(guān)鍵是排除Rnase的污染并抑制其活性，因此在制備過程中應(yīng)注意：,1.實驗室保持潔凈2.超凈臺保證規(guī)范操作2.戴手套和口罩3.玻璃器皿200℃干烤2h4