二乙酰一肟檢測尿素概論

1、尿素的測定,簡 介,尿素又稱脲，是體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝的含氮終產(chǎn)物，不與血漿蛋白結(jié)合，分子量僅為60，體內(nèi)生成量受蛋白質(zhì)攝入量，機(jī)體蛋白質(zhì)分解代謝及肝臟（生成尿素的唯一器官）功能的影響。 尿素是表明游泳池水受到人體污染程度的一項重要指標(biāo)。,二乙酰一肟（diacetylmonoxime）法檢測尿素（urea）含量,原理：尿素與二乙酰在酸性環(huán)境中加熱可縮合成紅色的二嗪衍生物，顏色深淺與尿素含量成正比。因二乙酰不穩(wěn)定，故通常

2、用二乙酰一肟代替，它與強(qiáng)酸作用，產(chǎn)生二乙酰。后者再與尿素反應(yīng)，縮合生成紅色的二嗪衍生物。,臨床二乙酰一肟法,H+二乙酰一肟+水 → 二乙酰+羥胺 H+二乙酰+尿素 → 二嗪化合物（粉紅色）,泳池二乙酰一肟法,臨床二乙酰一肟法測定尿素,1 原理 尿素與二乙酰一肟在酸性條件下，經(jīng)鎘離子（或三價鐵離子）的催化產(chǎn)生縮合，并在氨基硫脲存在下，生成了4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物

3、，顏色深淺與尿素含量成正比。,2 試劑2．1 酸性試劑：在 1 L容量瓶中加入蒸餾水約 100 mL，然后加入濃硫酸 44 mL 及 85 %磷酸 66 mL，冷卻至室溫后加入硫氨脲 80 mg，硫酸鎘 2 g，溶解后用蒸餾水稀釋至 1 000 mL，貯棕色瓶中放冰箱內(nèi)保存半年不變。2．2 2 %二乙酰一肟溶液：取 2 g 二乙酰肟，溶于蒸餾水中，定容 100 mL混合均勻，即可使用。尿素使用液：取酸性試劑 90 m

4、L加 2 %二乙酰一肟 10 mL，混合均勻即可。,3 方法3．1 定性測定：取使用液 2 mL 加入試管中，加 0.1 mL牛奶，在電爐上快速加熱至煮沸，保持沸騰 1 min，觀察顏色，用不含尿素樣品做比較。正常奶顏色為淡紅色，添加尿素的牛奶反應(yīng)顏色為玫紅色。3．2 定量測定：取5mL使用液加入0.1mL牛奶，于20 mL的螺口試管中，加蓋擰緊，于 95 ℃水浴中反應(yīng) 20 min，過濾后，于 525 nm處測定吸

5、光值。,4 結(jié)果 由于正常牛奶中含有少量的尿素，所以正常牛奶的反應(yīng)試管也是有顏色的，由于尿素含量較少，所以顏色為淡紅色。尿素含量異常的牛奶，反應(yīng)后顏色為玫紅色。兩者的區(qū)別明顯，在實際的質(zhì)量控制中，應(yīng)以正常奶做比較，來判斷原料奶中尿素含量的水平，進(jìn)而做出判斷。,5 小結(jié)優(yōu)點：靈敏度高，操作簡單，適用于自動儀器分析。缺點：反應(yīng)不專一，線性范圍窄（<150mmol/L),特異性低，試劑腐蝕性強(qiáng)，加熱有異味釋放。

6、難以實現(xiàn)自動化。,游泳池水中二乙酰一肟的檢測方法,常采用衛(wèi)生部頒發(fā)的二乙酰一肟分光光度法(簡稱原法) 。,二乙酰一肟分光光度法（國標(biāo)法）,1. 原理 尿素與二乙酰一肟及安替比林反應(yīng)呈現(xiàn)黃色, 在波長460 nm 處有最大吸收峰,與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。,2 試劑2．1　二乙酰一肟溶液(2 g/L) : 取0．2g二乙酰一肟[CH3COC (NOH) CH3 ]溶于10% 乙酸中,并稀釋至100 ml,保存于棕色瓶

7、中。2．2　安替比林溶液(2 g/L) :取0．2g安替比林[C6H5NN(CH3 )C(CH3 )CHCO]溶于1 + 1硫酸中并稀釋至100 ml,保存于棕色瓶中。2．3　尿素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(100μg/ml)和尿素標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(10μg/ml) 。2．4　儀器和器材UV - 2102C型分光光度計、沸水浴鍋、25 ml棕色具塞比色管(粗細(xì)、玻璃厚薄均勻一致) 。,3 分析步驟3．1 吸取水樣10ml（尿素含量在0

8、．001～0．015mg范圍內(nèi)）于25ml棕色具塞試管中，另取棕色具塞試管加入尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0．1、0．3、0．5、0．7、0．9、1．1、1．3、1．5ml，并用純水稀釋至25ml。（注：顯色后溶液遇光退色，故需用標(biāo)色法）。3．2 于上述各管加入1．0ml二乙?！咳芤海炀?。再加安替比林溶液2．0ml，混勻。3．3 將上述試管在沸水浴中加熱50min。取出并在流動的自來水中冷卻2min。立即以純水為對照，在460nm處，

9、用1cm比色皿，測定各管吸光值（加熱45～55min，呈最深色，若再延長時間吸光值下降）。3．4 以濃度對照吸光值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以水樣吸光值從曲線上查出尿素含量。,4 小結(jié),優(yōu)點：操作簡便、靈敏度高。 缺點：線性范圍窄、反應(yīng)時間長、標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)難以達(dá)到0.1999以上，對于尿素濃度高的水樣,雖可將水樣稀釋后進(jìn)行測定,但稀釋倍數(shù)難以估計, 所以需反復(fù)重測 , 既費時,又浪費試劑。,二乙酰一肟分光光度法（改進(jìn)）,1 原理

10、 目前二乙酰一肟-安替比林分光光度計[ 1] 是測定尿素的唯一標(biāo)準(zhǔn)方法, 該法存在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍較窄( 011 ~ 11 5 m g /L), 吸光度偏低,反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定, 溶液顯色后遇光褪色等多種問題, 對檢測結(jié)果影響較大, 為此本法參閱有關(guān)文獻(xiàn)[ 2, 3] , 通過摸索, 將國標(biāo)法中的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)大,

11、 定容體積由25 m l改為10 ml, 使線性范圍變寬, 吸光度的值增大, 標(biāo)準(zhǔn)系列的穩(wěn)定時間長, 結(jié)果滿意, 其準(zhǔn)確度、精密度較好, 能滿足基層實驗室的需要。,2 試劑2．1 0．2％二乙酰一肟溶液：稱取0．2g二乙酰一肟［CH3COC：（NOH）CH3］溶于10％乙酸中，并稀釋至100ml，保存于棕色瓶備用。2．2 0．2％安替比林溶液：稱取0．2g安替經(jīng)林（1，5－二甲基－2－苯－3－吡唑酮C6H5NN（CH3）C（

12、CH3）：CHC：O），溶于1＋1硫酸中并用混酸稀釋至100ml，棕色瓶中保存。（注：硫酸濃度大于1＋1時，顯色緩慢且操作不便。）2．3 尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0．1000g尿素于小燒杯中，加少量純水溶解后轉(zhuǎn)入1000ml容量瓶中，加0．1ml氯仿并用純水定容，此液每ml含0．1mg尿素。冷藏保存。2．4 尿素標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，準(zhǔn)確吸取尿素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液10．00ml于100ml容量瓶中，用純水定容，此液每ml含0．01mg尿素。,

13、3 分析步驟3．1取游泳池水樣10 ml于25 ml比色管中。另取尿素標(biāo)準(zhǔn)使用溶液( 10μg/ml) 0、0．25、0．50、1．00、2．00、3．00、4．00、5．00、6．00 ml (尿素含量為0、2．5、5、10、20、30、40、50、60μg) ,各管加純水至10 ml,做標(biāo)準(zhǔn)系列。3．2樣品及標(biāo)準(zhǔn)系列管各加入110 ml二乙酰一肟溶液,搖勻,再加入210 ml安替比林溶液,混勻后置沸水浴鍋中煮沸20 min (建

14、議同時放入同時取出,或按次序放入、取出,以保證加熱時間的一致。在樣品多時這點尤為重要) ,在沸水浴時輕輕蓋上比色管塞,以防溶液蒸發(fā)。3．3停止加熱后在冷水浴(10℃～15℃,冷水浴水位高于比色管中溶液為佳) 中冷卻2 min, 再次混勻后以純水為對照, 在460 nm處,用1 cm 比色皿,在避免陽光直射的條件下測定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得樣品中尿素的濃度。,4 小結(jié) 用改進(jìn)后的二乙酰一肟比色定量法,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

15、較原法有了很大提高,最高濃度可以測到610 mg/L,超過610 mg/L 的水樣進(jìn)行一倍稀釋基本上均在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍以內(nèi), 并保持原法的精密度與回收率; 煮沸時間由原來的50 min縮短至20 min,消除了由于長時間煮沸造成的各管溶液體積不一致、從而導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確的弊端;方法的精密度、準(zhǔn)確度好,優(yōu)于原法,且符合衛(wèi)生檢驗的要求。,國標(biāo)法改進(jìn)前后對照表,,二乙酰一肟-氨基硫脲（thiosemicarbazide）法,,氨基硫脲,作

16、用,酸性試劑中的氨基硫脲與硫酸鎘可促進(jìn)尿素與雙乙酰結(jié)合，提高靈敏度和顯色后的穩(wěn)定性。,化學(xué)式,CH5N3S,結(jié)構(gòu)式,,H2N,,N,H,,,C,II,S,,,NH2,起主要作用,2（NH2)2-C=O + 2（NH2)2-C=S-----（NH2)2-C=C(NH2)2 + SO2 + S（尿素） （氨基硫脲）,反應(yīng)關(guān)系式,1．原理 　 尿素在氨基硫脲存在下，與二乙酰一肟在強(qiáng)酸環(huán)境中加熱，生成紅色的二嗪衍生物。顯

17、色強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與尿素含量成正比。,2 試劑2．1 酸性試劑 濃硫酸200ml與磷酸300ml混勻，冷至室溫。加 氨基硫脲50mg，硫酸鎘2.0g溶解，棕色瓶冷藏至少可保存一年。2．2 二乙酰一肟溶液 稱取4.0g二乙酰一肟，溶解后加純水至200ml，棕色瓶冷藏可保存半年。2．3 尿素標(biāo)準(zhǔn)貯存液 準(zhǔn)確稱取0.1000g尿素，加少量純水溶解 后，移至1000ml容量瓶中，加5滴三氯甲烷作防腐劑，用純水定容至刻度

18、。4℃保存，此溶液尿素濃度為0.1mg/ml。2．4 尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液 臨用時將尿素標(biāo)準(zhǔn)貯存液稀釋10倍。此溶液尿素濃度10ug/ml。,3 操作步驟3．1取水樣10ml于具塞標(biāo)準(zhǔn)比色管中。另取比色管8只，分別加入10ug/ml的尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00ml，各加水至約10ml。3．2 每管各加酸性試劑5.0ml，2%的二乙酰一肟溶液2.0ml，加純水至25ml。沸水

19、浴12分鐘，取出后用冷水冷卻至室溫。3．3 以空白管調(diào)零，在540nm處，用1cm比色皿測定各管吸光值。以濃度對照吸光值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以水樣的吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出尿素含量。,4 結(jié)果 本法操作簡便，溶液顯色穩(wěn)定，線性范圍寬，試劑穩(wěn)定時間長，適合平時工作中使用。,,作用,作顯色穩(wěn)定劑。,化學(xué)式,（CH3）2CHOH,結(jié)構(gòu)式,,H3C,異丙醇,,,CH,,,,CH3,I,OH,二乙酰一肟-異丙醇-安替比林法,1 原理

20、 在原發(fā)的基礎(chǔ)上，選擇異丙醇作顯色穩(wěn)定劑對游泳池水中尿素進(jìn)行測定，使標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍有了很大的提高，縮短了煮沸時間，方法的精密度、準(zhǔn)確度優(yōu)于原法，且符合衛(wèi)生檢驗要求。,2 試劑 2.1 二乙酰一肟-異丙醇溶液 稱取1.0g二乙酰一肟溶于1+9乙酸溶液中，并使其總量為100ml，于此溶液中加入異丙醇50ml，混勻，棕色瓶中保存。2.2 安替比林溶液 稱取0.2g安替比林溶于1+1硫酸中，并使其總量為10

21、0ml，棕色瓶中保存。2.3 尿素標(biāo)準(zhǔn)貯備液 稱取0.1000g尿素，溶于少量水后移入1000ml容量瓶中，加0.1ml氯仿并用水定容，冷藏保存，此液1.00ml含0.100mg尿素。2.4 尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液 吸取尿素標(biāo)準(zhǔn)貯備液10.00ml于100ml容量瓶中，以水定容，此液1.00ml含10. 0ug尿素。2.5 實驗用水均為去離子水。,3 測定步驟3.1 吸取水樣10.0ml于25ml無色具塞比色管中，另取同型比

22、色管分別加入尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，以水定容至25ml。3.2 于上述各管中加入二乙酰一肟-異丙醇溶液1.50ml，混勻。再加入安替比林溶液2.00ml，混勻。3.3 各管加塞后同時置沸水浴中加熱20min，取出，在流動的自來水中冷卻2min。以水為對照，于460nm處，用1cm比色皿測定各管吸光度。3.4 計算標(biāo)準(zhǔn)系列直線回歸方程，以水樣吸光度代入方程，求

23、出水樣尿素含量。,4 小結(jié) 與標(biāo)準(zhǔn)方法比較，有遇光不退色，可用普通無色比色管操作；線性范圍擴(kuò)大，一般游泳池水樣可不經(jīng)稀釋一次完成測定；沸水浴時間大大縮短，節(jié)約時間等優(yōu)點。應(yīng)用于游泳池水中尿素的測定，其重現(xiàn)性、回收率、與標(biāo)準(zhǔn)方法的對照試驗，均獲得滿意結(jié)果。,臨床與預(yù)防二乙酰一肟法的區(qū)別,,3 討論3.1 嘗試以異丙醇、異丁醇、正戊醇、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甲醛、正辛醇、異戊醇等十余種有機(jī)溶劑作顯色穩(wěn)定劑試驗，

24、結(jié)果顯示：甲醛使顯色無法進(jìn)行；正辛醇、異戊醇水溶性差，溶液出現(xiàn)混濁；其余試劑均有顯色穩(wěn)定作用，但以異丙醇顯色后最穩(wěn)定，靈敏度較高，水溶性好，且為常用試劑，無毒，易購得，故選之。異丙醇的使用，彌補了標(biāo)準(zhǔn)方法3.2 經(jīng)實驗，異丙醇用量在0.4~0.6ml/管時，空白值較低，靈敏度較高，穩(wěn)定性好，故選其中間值（0.5ml/管），按此比例將其與二乙酰一肟試劑混合后加入，操作方便，且不影響二乙酰一肟試劑的穩(wěn)定性。3.3 當(dāng)二乙酰一肟溶液用

25、量為1ml/管，其濃度為10g/L與20g/L時，靈敏度較高，且兩者基本相同，而當(dāng)其濃度為2g/L時，靈敏度大大降低，故選其濃度為10g/L。因其與異丙醇混合后一次加入，為達(dá)二物質(zhì)最佳顯色量，故該混合試劑加入量為1.5ml。,3.4 當(dāng)安替比林溶液用量為2ml/管，濃度為2g/L與10g/L時，對測定基本無影響，故保持標(biāo)準(zhǔn)方法中該試劑2g/L的濃度。3.5 實驗表明，沸水浴時間從15~40min，隨加熱時間的延長，吸光度增加，標(biāo)準(zhǔn)

26、斜率加大，繼續(xù)延長加熱時間，則線性變差。加熱25min時，50ug管吸光度近0.8，儀器測定誤差加大，故本法選用沸水浴加熱20min，比標(biāo)準(zhǔn)方法的沸水浴50min時間大大縮短。因沸水浴時間不同，吸光度差別較大，故水樣應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列同批測定。同時，沸水浴容量應(yīng)較大，避免過擠致受熱不勻，使反應(yīng)不均勻、完全。3.6 作標(biāo)準(zhǔn)系列及水樣顯色定容后立即至26h穩(wěn)定性試驗，實驗結(jié)果顯示：在顯色定容后2h內(nèi)呈色穩(wěn)定，測定偏差小，比色測定最好在此期間完

27、成。延長至20h間，吸光度值逐漸增大，但在此期間只要標(biāo)準(zhǔn)系列與水樣為同批測定，對低、中濃度樣品結(jié)果基本無影響，高濃度樣品偏差稍大，但尚可接受（相對偏差＜5%）。若再延長時間則不可取。3.7 《游泳場所衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB9667-1996）中規(guī)定尿素應(yīng)≤3.5mg/L。本法線性范圍包容了上述濃度，對一般水樣可直接一次測定完成，避免了標(biāo)準(zhǔn)方法測定尿素濃度在1.5~5mg/L水樣時，因超出線性范圍需將樣品稀釋后重新測定的麻煩及引入的誤差。,

28、本法從十余種有機(jī)溶劑中篩選出異丙醇作顯色穩(wěn)定劑，并經(jīng)反復(fù)實驗研究，對游泳池水中尿素測定的標(biāo)準(zhǔn)方法作了改進(jìn)。與標(biāo)準(zhǔn)方法比較，有遇光不退色，可用普通無色比色管操作；線性范圍擴(kuò)大，一般游泳池水樣可不經(jīng)稀釋一次完成測定；沸水浴時間大大縮短，節(jié)約時間等優(yōu)點。應(yīng)用于游泳池水中尿素的測定，其重現(xiàn)性、回收率、與標(biāo)準(zhǔn)方法的對照試驗，均獲得滿意結(jié)果。,自己的想法,,化學(xué)性質(zhì)： 紅色粉末，微溶于水，溶于醇和稀酸。主要用于鑒定羰基化合物

29、（-CO）。是易燃易爆品，需小心使用。顯色作用： 在酸性介質(zhì)中，羰基化合物與2，4-二硝基苯肼（的甲醇-鹽酸溶液）反應(yīng)，生成 2，4-二硝基苯腙，在堿性溶液中呈暗紅色，可用于分光光度法 （445nm處測吸光度）或目視比色法測定羰基化合物。,關(guān)于2,4-二硝基苯肼做顯色劑替代安替比林的說明,反應(yīng)方程式：C6H3(NO2)2NHNH2+CO(NH2)2 C6H3(NO2)2NHN=C(NH2)2 +H