認識核酸在生命科學上重要性

1、不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,1,核 酸,,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,2,認識核酸在生命科學上的重要性弄清堿基、核苷、核苷酸和核酸分子結構上的關系了解核酸的化學本質(zhì)及DNA和RNA在組分、結構和功能上的差異認識核酸的結構與其性質(zhì)與功能之間的關系。,學習要求,上頁 下頁 章首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,3,1868年 F.Mi

2、escher首先從傷員繃帶的膿細胞中分離得到稱為“核素”的核酸1944年 O.N.Avery通過轉(zhuǎn)化實驗證實DNA是主要的遺傳物質(zhì)1953年 J. D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA 雙螺旋結構模型 1958 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則1970s 建立DNA重組技術1980s后 分子生物學、分子遺傳學等學科突飛猛進發(fā)展，提出并完成HGP,核酸化學的發(fā)展過程,上頁 下頁 章首,一. 核酸的概念和

3、重要性二. 核酸的化學組成及其基本結構單位核苷酸三. 核酸的一級結構及其測定四. DNA的高級結構五. RNA的高級結構六.核酸和核苷酸的理化性質(zhì)七.核酸的分離提取和純化,本章目錄,上頁 下頁 章首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,5,一.核酸的概念和重要性,,核酸的概念核酸的重要性,上頁 下頁 章首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,6,核酸的概念,核酸是酸性的大分

4、子物質(zhì)，在活細胞中與堿性蛋白結合，以核蛋白形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸 ( DNA )以及核糖核酸 (RNA)兩類，DNA所含核苷酸分子數(shù)比RNA大得多。 RNA分為三個類型，即核蛋白體 RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)和轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)，它們都參與蛋白質(zhì)合成,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,7,脫氧核糖核酸和核糖核酸異同的對比,上頁 下頁 章首 節(jié)首,

5、不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,8,DNA和RNA,返回,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,9,DNA是遺傳的物質(zhì)基礎，負責遺傳信息的貯存和發(fā)布，遺傳基因就是DNA鏈上的若干核苷酸所組成的片段。RNA負責遺傳信息的表達，直接參與蛋白質(zhì)生物合成，轉(zhuǎn)錄DNA所發(fā)布的遺傳信息，并將之翻譯給蛋白質(zhì)，使生命機體的生長、發(fā)育、繁殖和遺傳得以繼續(xù)進行。,核酸的重要性,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞

6、步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,10,核酸類物質(zhì)RNA的重要功能,返回,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,11,二.核酸的化學組成及其基本結構單位核苷酸,,核酸的化學組成核酸的基本結構單位核苷酸,上頁 下頁 章首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,12,核酸的化學組成,元素組成：C、H、O、N、PP元素的含量較多并且恒定，約占9～11%。核酸在酸、堿或酶作用下會

7、水解成核苷酸，進一步水解可得堿基(嘌呤或嘧啶)，戊糖(核糖或脫氧核糖) 和磷酸,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,13,組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為 β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。,(一)戊糖,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,14,(二)堿基(嘌呤和嘧啶）,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，

8、無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,15,常見的嘌呤和嘧啶,上頁 下頁 章首 節(jié)首,,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,16,(三)核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵,上頁 下頁 章首 節(jié)首,嘧啶核苷,嘌呤核苷,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,17,,幾種稀有核苷,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無

9、以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,18,,幾種稀有核苷,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,19,（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸,上頁 下頁 章首 節(jié)首,嘧啶核苷,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,20,（四）核苷酸（nucleotide）脫氧核苷酸,上頁 下頁 章首

10、 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,21,（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,22,（五）核苷酸衍生物,上頁 下頁 章首 節(jié)首,1. 繼續(xù)磷酸化,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,23,（五）核苷酸衍生物,上頁 下頁 章首 節(jié)首,2.環(huán)化磷酸化,cAMP,cGMP,不積蹞步，無以

11、致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,24,3. 肌苷酸及鳥苷酸(特鮮味精),4. 輔酶 NAD、NADP、FMN,,IMP GMP,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,25,三. 核酸的一級結構及其測定,核酸的一級結構核苷酸序列分析,上頁 下頁 章首,不積蹞步，無以致千里

12、；不積小流，無以成江海 友友情分享,26,核酸的一級結構,核酸的一級結構是核酸中各核苷酸化學鍵連接方式即核苷酸排列順序。 核苷酸通過3’，5’-磷酸二酯鍵連接起來，以磷酸-糖-磷酸-糖…形成核酸骨架,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,27,RNA，DNA一級結構示意圖,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,28,

13、核酸的表示方式,DNA RNA,5′PdAPdCPdGPdTOH 3′ 5′PAPCPGPUOH ′ 或5′ACGTGCGT 3′ 5′ACGUAUGU 3′ ACGTGCGT

14、 ACGUAUGU,若不特別注明，一般規(guī)定從5′端書寫至 3′端,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,29,核酸分子的核苷酸序列分析是以純品核酸為材料，經(jīng)水解，測定核苷酸組成及比例。先以外切酶確定5’-或3’-末端核苷酸，再以內(nèi)切酶將核酸鏈分為若干寡核苷酸段，分段測定核苷酸組成、比例和序列。最后將核苷酸序列的各寡核苷酸重疊，確定整個核酸分子的

15、核苷酸序列。,核酸序列分析,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,30,核苷酸序列分析中斷裂磷酸二酯鍵用酶,返回,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,31,DNA酶法測序,1977年sanger發(fā)明末端終止法測定DNA序列根據(jù)sanger測序法，現(xiàn)在已經(jīng)有各種DNA自動測序儀，DNA測序速度大大加快HGP得以提前完成,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里

16、；不積小流，無以成江海 友友情分享,32,DNA酶法測序,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,33,DNA酶法測序,上頁 下頁 章首 節(jié)首,平行進行四組反應，每組反應均使用相同的模板，相同的引物以及四種脫氧核苷酸；并在四組反應中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機地接入DNA鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應的四組具有特定長度的、不同長短的DNA鏈。這四組DNA鏈再經(jīng)過聚丙烯酸胺

17、凝膠電泳按鏈的長短分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測DNA的核苷酸序列,如下圖所示：,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,34,DNA酶法測序,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,35,DNA酶法測序,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,36,四. DNA的高級結構,DNA的二級結構DNA的三級結

18、構,上頁 下頁 章首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,37,DNA的二級結構,DNA的二級結構是雙螺旋結構，即兩條多聚核苷酸鏈圍繞一個共同軸，相互盤繞在一起構成直徑 2nm的雙螺旋，互補的堿基(A和T互補 ，G和C互補)通過氫鍵連接在螺旋內(nèi)部，堿基平面垂直于右旋的螺旋軸。螺旋結構中兩條鏈走向相反,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,38,DNA的二級結構類型,

19、上頁 下頁 章首 節(jié)首,B型結構 兩條鏈反向平行，右手螺旋 堿基在內(nèi)（A＝T，G≡C）堿基平面垂直于螺旋軸 戊糖在外，雙螺旋每轉(zhuǎn)一周為10堿基對（bp）A型結構 堿基平面傾斜20º，螺旋變粗變短，螺距2～3nm。Z型結構 左手螺旋，只有小溝,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,39,DNA雙螺旋結構示意圖,返回,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友

20、情分享,40,DNA的分子節(jié)段及堿基配對示意圖,返回,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,41,穩(wěn)定DNA雙螺旋結構的三種力量氫鍵：使四種堿基形成特異配對關系，G-C間可形成3對氫鍵，A-T之間有兩對氫鍵 。疏水相互作用：軸向平行相鄰的堿基平面自發(fā)地相互靠近，從而使堿基締合、層層堆積，形成了堿基堆積力 ，它是使DNA結構穩(wěn)定的主要力量。 離子鍵：磷酸殘基上的負電荷與介質(zhì)中的正離子，如Na+，K+，Ｍg＋等之間形

21、成的離子鍵。,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,42,,核酸的三級結構指鏈狀核酸分子的空間構型，即其三維空間排列或組合方式。,DNA的三級結構,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,43,DNA的三級結構主要有以下三種：,松弛環(huán)形,超螺環(huán)形,開鏈環(huán)形,DNA的三級結構,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成

22、江海 友友情分享,44,回文結構與鏡像結構,特殊DNA的結構,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,45,回文結構中的單鏈可形成發(fā)夾結構,特殊DNA的結構,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,46,雙鏈回文結構可形成十字架結構,特殊DNA的結構,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,47,五. RN

23、A的高級結構,RNA的二級結構RNA的三級結構,上頁 下頁 章首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,48,RNA的二級結構,RNA的二級結構基本上是單股分子，其二級結構比DNA簡單的多，但也存在少數(shù)堿基配對區(qū)域即雙螺環(huán)結構。,,RNA單鏈的折疊,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,49,（1）占總RNA的15％（2）一種氨基酸對應最少一種RNA（3）分

24、子中含有較多修飾成分（4） 3‘-末端都具有CCAOH結構（5）半數(shù)堿基可經(jīng)過自身回折，形成局部雙螺旋“莖” 結構，其間是單鏈形成的“環(huán)”。絕大多數(shù)tRNA經(jīng)過這樣的折疊形成4個莖和4個環(huán)組成的特征性三葉草形二級結構 。,上頁 下頁 章首 節(jié)首,1、tRNA,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,50,占總RNA的80％,上頁 下頁 章首 節(jié)首,2、rRNA,5sRNA的二級結構,不積蹞步，無以致千里；不積

25、小流，無以成江海 友友情分享,51,占總RNA的3％～5％,上頁 下頁 章首 節(jié)首,3、mRNA和hnRNA,真核細胞mRNA的3‘-末端有一段長達200個核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為 “尾結構” ，5’ -末端有一個甲基化的鳥苷酸，稱為” 帽結構“ 。,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,52,占總RNA的3％～5％,上頁 下頁 章首 節(jié)首,3、mRNA和hnRNA,原核生物mRNA特征：

26、 先導區(qū)+翻譯區(qū)（多順反子）+末端序列真核生物mRNA特征： “帽子”（m7G-5´ppp5´-N-3´p）+單順反子+“尾巴”（Poly A）,原核細胞mRNA的結構特點,,真核細胞mRNA的結構特點,,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,55,在tRNA二級結構中未配對的某些并不互補的堿基參與了三級結構中特殊的氫鍵作用，tRNA鏈中的核糖-磷酸骨架與某些堿基甚至其他的骨架之間也

27、能產(chǎn)生作用。,RNA的三級結構,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,56,六.核酸和核苷酸的理化性質(zhì),核苷是無色的晶體或粉末，熔點較高。在水中的溶解度嘧啶核苷比嘌呤核苷大，在有機溶劑中一般不溶解。由于戊糖有不對稱的C原子，使其具有旋光性。  天然DNA分子長度可達幾厘米，而分子直徑只有20埃米。這種細絲狀的雙螺旋結構賦于DNA 一系列顯著的物理化學特性。 由于RNA分子比D

28、NA短` 而且小的多,只有部分雙螺旋結構區(qū)，呈不定形，沒有像 DNA那樣明顯的物理、化學特性。,上頁 下頁 章首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,57,沉降特性高分子量高粘度紫外吸收酸堿性質(zhì)變性復性,核酸和核苷酸的理化性質(zhì),上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,58,溶液中的核酸在引力場中可以下沉，在超速離心機造成的極大的引力場下，核酸分子下沉的速率大大加

29、快。應用超速離心技術，可以測定核酸的沉降常數(shù)、分子量和構象。測定DNA分子量時，由于它的粘度大，應采用其稀溶液。,沉降特性,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,59,目前核酸的分子量用電子顯微鏡照相，放射自顯影凝膠電泳等技術來測定。部分核酸分子量和核苷酸數(shù)：,,,高分子量,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,60,DNA的粘度比RNA的大得

30、多。當核酸溶液因受熱或在其他因素作用下發(fā)生螺旋向線性過渡時，粘度會降低。,高粘度,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,61,由于核酸組分嘌呤和嘧啶具有強烈的紫外吸收性能，所以核酸也有強烈的紫外吸收，最大吸收值在260nm處。這可作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。,紫外吸收,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,62,酸堿性質(zhì),上頁 下頁

31、章首 節(jié)首,核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質(zhì)。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點偏酸性。DNA的pI約為4～5，RNA的pI約為2.0～2.5，在pH7～8電泳時泳向正極。,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,63,在一定物化因素(熱、酸、堿 作用下)，DNA分子內(nèi)的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開，發(fā)生變性。 RNA僅局部呈雙螺旋結構，其螺旋形結構向線團形結構轉(zhuǎn)化不如DNA明顯

32、。核酸降解、變性時，其對紫外吸收增加，這種現(xiàn)象稱為增色效應變性DNA在適當條件下(如緩慢冷卻)可使兩條分開的鏈重新締合成雙螺旋結構，這過程叫復性。復性過程產(chǎn)生減色效應,變性與復性,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,64,DNA熱變性及復性示意圖,返回,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,65,DNA熱變性的Tm值,返回,DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)

33、間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85?C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關，G和C的含量高，Tm值高。可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,66,七.核酸的分離提取和純化,DNA的分離RNA的分離核酸含量測定：定磷法

34、 紫外線吸收法 定糖法核酸的純化及其要求,上頁 下頁 章首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,67,核蛋白的提?。赫婧思毎蠨NA常和組蛋白結合以核蛋白形式存在，把真核細胞搗碎后加入0.9%NaCl和0.01M檸檬酸鈉溶液，使DNA蛋白質(zhì)沉淀，而檸檬酸鈉是起抑制DNA的降解作用。核酸與蛋白質(zhì)的分離：利用核蛋白溶于1mol /L Na

35、Cl的性質(zhì)，將其從細胞勻漿中分離出來，用飽和苯酚等溶劑與上述核蛋白共振，冰凍離心。 DNA溶于上層水相中，變性蛋白留在酚層內(nèi)。在水相加入2.5倍體積無水乙醇，將其沉淀出來，再以核酸酶水解以除去RNA。最后借助密度梯度平衡超速離心法或?qū)游鲋?，分離DNA。,DNA的分離,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,68,DNA的精制：制得的DNA中還含少量蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，將它溶解在蒸餾水中，加入陰離子

36、去污劑硫酸十二酯鈉進一步作用于DNA和蛋白，使蛋白質(zhì)與核酸分離而沉淀，通過高速離心去掉蛋白質(zhì)，在上層DNA溶液加入95%乙醇沉淀DNA，經(jīng)過乙醇重復洗幾次，可得DNA精制品。,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,69,核蛋白的提?。簩⒓毎扑橹瞥蓜驖{，再用0.14mol /L NaCl溶液將細胞質(zhì)的核糖核蛋白體抽提出來，留下含DNA的細胞核組織，核糖核蛋白可在pH4.5溶液中沉淀析出。

37、核酸和蛋白質(zhì)的分離：含水的酚能沉淀蛋白質(zhì)，核酸和多糖則溶于水層。水層中的RNA和多糖可被乙醇沉淀，將沉淀再溶于磷酸鹽緩沖液，然后用?-甲氧乙醇抽提RNA，用乙醇沉淀得RNA。,RNA的分離,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,70,RNA的精制： 在粗制的RNA中加入磷酸鹽，醋酸鹽，乙二醇甲醚并攪拌，使多糖類物質(zhì)溶于水里，RNA溶于乙二醇甲醚內(nèi)，靜置分層。從上層乙二醇甲醚取出加醋酸鈉，用十

38、六烷基三甲基溴化胺鹽使 RNA 沉淀，經(jīng)離心分離得RNA。,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,71,將試劑用濃硫酸或過氯酸消化，使核酸磷轉(zhuǎn)化成為無機磷酸。磷酸能與鉬酸銨反應生成磷鉬酸銨，它在還原劑存在下，可被還原生成鉬藍，再通過測定無機磷酸測定核酸。通常RNA平均含磷9.4%,而DNA含磷9.9% 。這樣可從含磷量推算出核酸的含磷量。,定磷法,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以

39、致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,72,利用核酸組分嘌呤環(huán)、嘧啶環(huán)具有紫外吸收的特性，在260nm下，每ml含1µg DNA的消光值(O.D.260)為0.020，每ml含1ug RNA的消光值為 0.022，由未知溶液的消光值可計算出其中核酸含量。,紫外線吸收法,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,73,RNA與濃硫酸共熱會降解，生成的核糖進而轉(zhuǎn)化為糖糠，它與地衣酚在C

40、uCl2或FeCl3催化下反應呈鮮綠色，在670nm處呈現(xiàn)最大光吸收。DNA經(jīng)加熱酸解后，水解所得的脫氧核糖轉(zhuǎn)變?yōu)棣?羥-γ-酮戊醛，再與二苯胺生成藍色物質(zhì)。在595nm處呈現(xiàn)最大光吸收。RNA和DNA在20~200µg/ml濃度時，光密度與核酸的濃度呈正比。,定糖法,上頁 下頁 章首 節(jié)首,不積蹞步，無以致千里；不積小流，無以成江海 友友情分享,74,,為保持核酸的生物活性，分離、分析必須在溫和條件下進行，防止過酸