一種基于Bn-Km抗性的微紫青霉菌菌株GXCR的插入誘變載體的構(gòu)建.pdf

1、目前，重金屬污染已成為環(huán)境中的重要污染物之一，也是全世界普遍關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題。絲狀真菌具有堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)細(xì)胞壁、孢子繁殖、基因組相對(duì)較小等形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征成為重金屬污染的生物修復(fù)的理想對(duì)象。闡明絲狀真菌重金屬的抗性機(jī)制研究其基因功能顯得尤為重要，而研究基因功能最直接簡(jiǎn)便的方法是反向遺傳學(xué)法，它是通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建覆蓋整個(gè)基因組的突變體庫(kù)，根據(jù)突所造成的表型分析從而確定基因的功能。近年來(lái)在真菌中發(fā)展的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有高效、穩(wěn)

2、定、高頻單拷貝隨機(jī)插入、適用范圍廣、成本低、操作方便和重復(fù)性好等特點(diǎn)，成為當(dāng)前研究絲狀真菌基因功能的主要工具之一。
　　 本實(shí)驗(yàn)室曾分離得到一株高抗多種重金屬鹽且對(duì)苯菌靈敏感的微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR，本研究在質(zhì)粒pG-Bn（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的T-DNA區(qū)已插入苯菌靈抗性基因的載體）的基礎(chǔ)上在其T-DNA區(qū)再插入卡那霉素抗性基因，構(gòu)建插入誘變載體命名為pG-Bn-Km，再由根癌農(nóng)桿菌

3、LBA4404介導(dǎo)產(chǎn)生GXCR菌株的插入突變體。從乙酰丁香酮（AS）的濃度、共培養(yǎng)的時(shí)間、共培養(yǎng)的溫度、受體菌孢子的濃度、農(nóng)桿菌的濃度、共培養(yǎng)的pH值6個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，求解該菌的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件，為今后通過(guò)插入誘變大規(guī)模鑒定該菌的的基因功能奠定基礎(chǔ)。其轉(zhuǎn)化的最適條件為AS濃度100μmol/L、農(nóng)桿菌OD600=0.45、GXCR孢子濃度106個(gè)/ml、共培養(yǎng)溫度32℃、共培養(yǎng)的pH=5.4、共培養(yǎng)60 hr，在此條件下，平均每106個(gè)