附— 實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)

1、1附—實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)實(shí)習(xí)一、動(dòng)物染色體標(biāo)本的制備與觀察一、實(shí)習(xí)目的：1.初步掌握動(dòng)物骨髓染色體標(biāo)本制備基本過(guò)程，了解操作步驟的原理。2.了解常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體的數(shù)目及特點(diǎn)。二、實(shí)習(xí)原理：凡細(xì)胞處于活躍增殖狀態(tài)，或者經(jīng)過(guò)各種處理后，細(xì)胞就可進(jìn)入分裂的任何動(dòng)物組織，均可用于染色體分析。在正常動(dòng)物體內(nèi)，骨髓是處于不斷分裂的組織之一。給動(dòng)物注射一定劑量的秋水仙堿即可使許多處于分裂的細(xì)胞停滯于中期，然后采用常規(guī)空氣干燥法制備染色體，即可得到大量可分

2、析的染色體標(biāo)本。本方法簡(jiǎn)便、可靠，不需要經(jīng)體外培養(yǎng)和無(wú)菌操作，易于推廣。三、實(shí)驗(yàn)用品1.材料小白鼠、無(wú)尾兩棲類蛙屬或蟾蜍屬動(dòng)物。2.器材水平離心機(jī)、顯微鏡、刻度離心管（10m1）、注射器（1ml）、載玻片、燒杯（400m1）、量筒（100m1）、試管架、鑷子、剪刀、解剖刀、吸管。3.試劑(1)2%檸檬酸鈉溶液：稱取2g檸檬酸鈉（檸檬酸三鈉，TrisodiumcitrateAR）溶解于100ml蒸餾水中。(2)1%檸檬酸鈉溶液。(3)50

3、0ugml、100mgm1秋水仙素（cochicine）溶液。(4)Giemsa（姬姆薩）原液（pH6.8）Giemsa染粉（Giemsastain）1g甘油（丙三醇，glycerineAR）31ml甲醇（methylalcoholAAR）45ml將染粉傾入研缽，加幾滴甘油，在研缽內(nèi)研磨直至無(wú)顆粒為止，此時(shí)再將全部剩余甘油倒入，放入60~65℃保溫箱中保溫2h后，加入甲醇攪拌均勻，保存于棕色瓶中備用。(5)0.067molL磷酸鹽緩沖液

4、（pH6.8）Na2HPO412H2O11.81g（或Na2HPO42H2O5.92g）KH2PO44.5g溶解于蒸餾水中至1000ml。(6)1:10Giemsa磷酸緩沖液染液（pH6.8）。(7)甲醇（AR）。(8)冰醋酸（AceticacidglacialAR）。(9)0.4%KCl（potassiumchlideAR）溶液。四、實(shí)習(xí)內(nèi)容1.小白鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備方法(1)動(dòng)物按4ugg體重的劑量經(jīng)腹腔注射秋水仙素，3~4h后

5、殺死動(dòng)物。(2)取出動(dòng)物后肢的脛骨和股骨。剪去兩端。(3)將0.6~1ml2%檸檬酸鈉用1ml注射器按上5#針頭注入骨髓腔，將骨髓細(xì)3本實(shí)習(xí)是掌握精巢染色體標(biāo)本制作方法，觀察細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中不同時(shí)期的染色體，了解性細(xì)胞形成過(guò)程中的染色體狀態(tài)。二、實(shí)習(xí)原理減數(shù)分裂，是性細(xì)胞形成過(guò)程中的特殊分裂方式。哺乳動(dòng)物在性成熟后，精巢內(nèi)的性細(xì)胞總是在分批分期相繼不斷地成熟，因此，對(duì)哺乳動(dòng)物的精巢進(jìn)行一定的技術(shù)處理，隨時(shí)都可獲得減數(shù)分裂過(guò)程中各期染色

6、體的標(biāo)本。三、器材和試劑1.器材顯微鏡、離心機(jī)、解剖器材、注射器、10ml刻度離心管、試管架、吸管、培養(yǎng)皿、載玻片。2.試劑2%檸檬酸鈉溶液、0.4%KCl溶液、冰醋酸、甲醇、秋水仙素（100ugml）。3.實(shí)習(xí)材料性成熟的雄性小白鼠四、實(shí)習(xí)步驟1.秋水仙素處理：取睪丸前3~4h先給小鼠經(jīng)腹腔注入秋水仙素(按4ugg體重)。2.取細(xì)精小管：用損傷脊髓法處死小鼠，放在解剖板上，固定四肢，剖開(kāi)腹腔取睪丸放入盛有2%檸檬酸鈉溶液的小培養(yǎng)皿中。

7、用小剪刀剪開(kāi)包在睪丸最外層的腹膜和白膜，用尖頭小鑷子從睪丸中挑出細(xì)線狀的細(xì)精小管。更換的檸檬酸鈉溶液將細(xì)精小管沖洗一次，再加5~6ml的檸檬酸鈉溶液，一起吸入離心管中。3.制細(xì)胞懸液：待細(xì)精小管沉入離心管后，用吸管頭將細(xì)精小管研碎（所選用的吸管要管頭平齊）。經(jīng)反復(fù)研磨和吹打，可使處于減數(shù)分裂過(guò)程中的各期細(xì)胞脫落在溶液中。然后吸掉肉眼所見(jiàn)的膜狀物，制成細(xì)胞懸液（同時(shí)有部分精子存在）。4.收獲細(xì)胞經(jīng)1000rmin離心10min，去上清液。

8、所得沉淀物，除少部分精子外，即是處于減數(shù)分裂過(guò)程中的各期細(xì)胞。5.低滲處理、固定、制片染色均與骨髓染色體制片實(shí)習(xí)相同（見(jiàn)實(shí)習(xí)一）。五、觀察1.尋找和觀察處于第一分裂時(shí)期的分裂相，表現(xiàn)出20對(duì)同源染色體相互配對(duì)的現(xiàn)象。20對(duì)同源染色體中有19對(duì)染色體呈環(huán)狀連接，只有XY染色體表現(xiàn)出特殊的一個(gè)末端和二個(gè)末端相接。而且Y染色體又出現(xiàn)一定程度的深染現(xiàn)象。2.尋找和觀察第二次減數(shù)分裂過(guò)程中的中期染色體，觀察處在染色單體尚未分離前的20個(gè)姊妹染色單