一節(jié)免疫細(xì)胞的分類與分離

1、免疫細(xì)胞的分離與檢測(cè),第一節(jié) 免疫細(xì)胞的分類與分離,一、免疫細(xì)胞的種類與特征二、免疫細(xì)胞的分離技術(shù)三、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇,免疫細(xì)胞的特征,1、免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征 理化性狀 生物學(xué)特性2、免疫細(xì)胞的膜分子特征 CD分子,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,免疫細(xì)胞的起源與分化,紅細(xì)胞 血小板 肥大細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞 漿細(xì)胞 T細(xì)胞 NK細(xì)

2、胞,免疫細(xì)胞的分離技術(shù),1、密度梯度離心法2、黏附分離法3、熒光激活分離法4、磁性分離法5、其他分離法,密度梯度離心法,離心前,離心后,稀釋抗凝血,淋巴細(xì)胞分離液,血漿,單個(gè)核細(xì)胞,粒細(xì)胞,紅細(xì)胞,沉降速度 =,2r2（Q—Q0）,9 ? ?,,x g,Q =顆粒比重 Q0 =溶質(zhì)比重 r =顆粒半徑? = 形狀因子 = 顆粒摩擦系數(shù)/同體積球型顆粒摩擦系數(shù)? = 粘稠度 g = 相對(duì)

3、離心力,人類血液有形成分的平均密度與直徑,密度 直徑（?）血小板 1.04—1.06 淋巴細(xì)胞 1.06—1.08 8—10粒細(xì)胞 1.08—1.09 13紅細(xì)胞 1.09—1.10

4、 7.5,,,,黏附分離法,尼龍毛法貼壁法親和板法吸附柱法,,熒光激活分離法（FACS）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,熒光檢測(cè)器,濾光片,透鏡,接物鏡,激光束,偏轉(zhuǎn)板,噴嘴,細(xì)胞收集管,流體護(hù)套,樣品,流式細(xì)胞儀,磁性分離法,磁鐵吸引法磁式細(xì)胞分類術(shù)法,MACS (陽性選擇法）,,,,,,N,S,MACS (陰性選擇法）,,,,,N,S,其他分離法,花環(huán)沉降法細(xì)胞活化克

5、隆法MHC分子四聚體法,抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù),細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇,細(xì)胞凍存的原理與方法細(xì)胞復(fù)蘇的原理與方法,細(xì)胞凍存罐,第二節(jié) 免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè),一、免疫細(xì)胞膜分子檢測(cè)的原理與類型二、免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè)方法,免疫細(xì)胞膜分子檢測(cè)的原理與類型,1、以抗體識(shí)別抗原2、以配體識(shí)別受體,免疫細(xì)胞膜分子的主要檢測(cè)方法,1、免疫標(biāo)記檢測(cè)方法 熒光抗體法 酶免疫檢測(cè)法 免疫金銀染色法2

6、、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）3、花環(huán)形成試驗(yàn),SmIg的熒光抗體檢測(cè)法,SmIg的酶免疫檢測(cè)法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）,染料,補(bǔ)體,,,,E-花環(huán),T細(xì)胞,B細(xì)胞,花環(huán)形成細(xì)胞,綿羊紅細(xì)胞,EA-花環(huán),,EAC-花環(huán),,,,第三節(jié) 免疫細(xì)胞功能測(cè)定,一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn)二、細(xì)胞毒試驗(yàn)三、抗體形成試驗(yàn)四、細(xì)胞吞噬與殺傷試驗(yàn),1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)2、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)

7、,轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn),,,,,,,放射性測(cè)定,3H-TdR,絲裂原（抗原）刺激,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理示意,1、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)2、NK活性測(cè)定3、ADCC作用測(cè)定,細(xì)胞毒檢測(cè)試驗(yàn),,放射性測(cè)定,細(xì)胞毒試驗(yàn)原理示意,,,,,,靶細(xì)胞,效應(yīng)細(xì)胞,分離上清,1、直接溶血空斑試驗(yàn)2、間接溶血空斑試驗(yàn)3、SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn),抗體形成試驗(yàn),直接溶血空斑試驗(yàn),,,,,,,,,,,,,,,,間接溶血空斑試驗(yàn),,,,,,,,,

8、,,,,,,,,SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn),1、細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)2、細(xì)胞殺菌功能試驗(yàn),細(xì)胞吞噬與殺傷功能試驗(yàn),,,吞噬百分率 =,吞有顆粒的吞噬細(xì)胞數(shù),計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù),,吞噬指數(shù) =,吞噬細(xì)胞吞噬的總顆粒數(shù),計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù),,NBT還原試驗(yàn),原理：,N-N-C + H+N=N-R-,,,,,,N-NH2C N=NH,,,,,四氮唑基（淡黃色）,甲月簪基（紫黑

9、色）,NBT還原試驗(yàn),方法：,1、抗凝血 + 硝基藍(lán)四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、鏡檢。,正常值：,NBT陽性細(xì)胞 7.5-15%,第四節(jié) 免疫細(xì)胞凋亡測(cè)定,一、細(xì)胞凋亡的概念與原理二、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法,細(xì)胞凋亡的概念與原理,1、細(xì)胞凋亡的概念2、細(xì)胞凋亡的原理3、細(xì)胞凋亡的特點(diǎn),細(xì)胞凋亡（apoptosis）,細(xì)胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的主動(dòng)死亡過程，也稱程序性死亡。,細(xì)胞凋亡的過程,凋亡

10、信號(hào)——凋亡受體——信號(hào)傳導(dǎo)——凋亡基因啟動(dòng)——編碼程序性死亡蛋白——細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體——細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡機(jī)制,細(xì)胞凋亡的特點(diǎn),1、細(xì)胞皺縮2、染色質(zhì)邊集3、凋亡小體出現(xiàn),細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法,1、形態(tài)觀察法2、生化檢測(cè)法3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法,形態(tài)觀察法,普通光鏡檢測(cè)——HE染色 甲基綠-派諾寧染色熒光顯微鏡檢測(cè)——溴化丙錠染色透射電鏡檢測(cè)——

11、典型形態(tài)改變,生化檢測(cè)法,凝膠電泳法原位末端標(biāo)記法二苯胺分光光度法,凝膠電泳法,原理：斷裂DNA在凝膠中呈梯形排列 （DNA ladder）方法：提取總DNA DNA凝膠電泳 觀察DNA ladder現(xiàn)象,原位末端標(biāo)記法（TUNEL）,原理：利用標(biāo)記的dUTP，在TdT作用 下結(jié)合DNA斷片的3’末端羥基，

12、 顯示斷鏈DNA，提示凋亡方法：制備組織切片 標(biāo)記物結(jié)合 標(biāo)記物顯色 鏡檢,二苯胺分光光度法,原理：細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生低分子量DNA，通過超速離心可與細(xì)胞核的高分子量DNA分離，分別測(cè)定兩種DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解細(xì)胞 13000g超速離心 分別提取DNA 使DNA顯色，測(cè)定

13、,凋亡百分率 =,上清液OD值,上清液OD值+沉淀OD值,,流式細(xì)胞儀法,原理：PI標(biāo)記凋亡細(xì)胞，通過FACS可 顯示凋亡細(xì)胞的特征性亞二倍體 峰。并可經(jīng)計(jì)算分析得出凋亡百 分率。方法：制備細(xì)胞懸液 PI染色 FACS檢測(cè),本章小結(jié),1、免疫細(xì)胞的類型與分離技術(shù)2、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇3、免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè)原