教育hiv艾滋病抗體實室檢測方法hiv上崗證培訓

1、主要內容,HIV檢測一般情況：窗口期、檢測樣本及流程關于樣本實驗室操作：采集、處理、檢測、轉運常用篩查方法,艾滋病檢測意義,艾滋?。河绊懭祟惤】档娜蛐詾碾y我國艾滋病的流行形勢也日趨嚴峻據估算，我國大約只有10%艾滋病病毒感染者被發(fā)現，其余90%處于未知狀態(tài)，這對相關的預防、治療和關懷工作帶來極大挑戰(zhàn)要找到尚未發(fā)現的感染者，實驗室檢測工作必不可少,感染HIV后的血清學變化,,,,,HIV RNA,濃度,,,,抗體,感染,

2、1周 2周 6周 12周 -年,窗口期,窗口期：機體感染HIV到能檢出抗體之間的時期 第三代HIV抗體檢測試劑盒能使大部分感染者在4-8周后檢測出HIV抗體如果到12周（即3個月）仍檢測不出抗體，基本可以排除HIV感染，對抗體檢測呈不確定反應或高危行為后高度懷疑有感染危險者，可再隨訪3個月后復檢。必要時可做HIV-1 p24抗原或HIV核酸檢測作為輔助診斷,,檢

3、測樣品： 血液、組織液、排泄物、組織、器官、精液以及有關血液制品、生物組織或其它物品等 進行艾滋病病毒HIV或其相應標志物的實驗室測定，包括HIV分離、抗原檢測、核酸檢測和抗體檢測等目前用于HIV診斷的常規(guī)方法為血液中HIV抗體檢測，我國目前檢測血液中HIV抗體的常規(guī)檢測程序分為篩查試驗（包括初篩和復檢）和確認試驗,HIV抗體篩查實驗流程圖,,樣本,陽性反應,一陰一陽,陰性反應,篩查檢測,均陽性反應,重復檢測,均陰性反應

4、,送確認實驗室進行確認,陰性報告,篩查試劑,原有試劑加另外一種篩查試劑,,,,,,,,,,,,,,,,,設備要求,主要儀器設備包括 生物安全柜、離心機、酶標讀數儀、洗板機、移液器、溫箱/水浴箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器所用的儀器應該校準，每次使用后應做記錄為保證人員安全，實驗室內的耗材最好使用塑料制品,標本要求,1．種類：血清或血漿(肝素、枸櫞酸鈉或EDTA抗凝)。2．量： 靜脈血2ml，常規(guī)分離血清或血漿。

5、 3. 3000轉／分離心10分鐘。4．保存：分離后7d之內測定的血清或血漿標本可放置于 2?8?C保存，超過7d在-20?C保存。,試劑要求,我國規(guī)定HIV抗體篩查試劑必須是：HIV-1/2混合型經國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準批批檢合格在有效期內推薦使用臨床質量評估敏感性和特異性高的試劑 （chinaids.org）,常用篩查方法,目前，國內常用的HIV抗體篩查試驗方法有：酶聯免疫吸附試驗（E

6、LISA）顆粒凝集試驗?。≒A）快速試驗,雙抗原夾心法原理,,,試劑盒組成（雙抗原夾心法ELISA）,1.HIV酶標板2.HIV-1型陽性對照 3.HIV-2型陽性對照 4.HIV陰性對照 5.HIV酶標試劑 6.濃縮洗滌液 7.顯色劑A液 8.顯色劑B液 9.終止液,操作程序 - 1,閱讀標準操作程序，嚴格按照試劑說明書操作將試劑盒及樣品放置在室溫半小時以上1）準備酶標板，小心撕去酶標板條上的封

7、條2）配液：將50ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋至1000ml備用。3）編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照3孔、陽性對照1型,2型各1孔、空白1孔。4）加樣：分別在相應孔中加入加入100 μl待檢樣品及陰、陽性對照、外部質控對照。,操作程序 - 2,5）溫育：用封板膜封板后置37±1℃溫育60±1分鐘。 6）洗滌：小心將封板膜揭掉，使用洗板機吸干孔內液體，用洗滌液洗滌5遍，拍干。7）

8、加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。8）溫育：用封板膜封板后置37±1℃溫育30±1分鐘。9)洗滌：小心將封板膜揭掉，使用洗板機吸干孔內液體，用洗滌液充分洗滌5遍，最后一次盡量拍干。。,操作程序 - 3,10）顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50μl，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置37±1℃避光顯色30±1分鐘。12）測定：每孔加終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀波長于45

9、0nm處（建議用雙波長檢測，可不設空白），在15分鐘內測定各孔OD值。13）用酶標儀測定OD值，打印結果,實驗結果判斷（1）,檢查陰性對照和陽性對照的OD值是否符合要求，判斷本次實驗是否成立，并計算cut off值結果判定:1.陰性對照的正常范圍： 正常情況下，陰性對照孔OD值≤0.10。2.陽性對照的正常范圍： 正常情況下，陽性對照孔OD值≥0.80。3.臨界值（CUTOFF）計算： 臨界值=陰

10、性對照孔OD均值Nc + 0.12。,實驗結果判斷（2）,4.陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為HIV 抗體陽性 （注意：初試陽性標本應重新取樣進行雙孔復檢，復試陽性者應按“全國HIV檢測管理規(guī)范”送HIV確證實驗室進行確證實驗）。5.陰性判定：樣品OD值＜臨界值（CUTOFF）者為HIV抗體陰性。,質控要求,一.室內質控：1. 在每次HIV實驗中必須包含內部對照質控血清（試劑盒配套質控）: HIVI抗體、HI

11、V2抗體陽性質控、HIV陰性質控及外部對照質控血清（自制或購買）。2.所有質控品與標本同時加入HIV試劑的微孔板內，最終質控結果符合實驗要求，則實驗結果可報告；否則應重新檢測標本。,,檢測過程中的問題及對策,ELISA實驗所有的孔均無色,漏加陽性對照酶標記物失效底物失效：應避光保存酶聯板抗原失效,ELISA實驗所有的孔均顯色,洗板不徹底，孔內殘留未結合的酶標記物。容器不清潔，有殘留物質：酶受污染。底物失效，在加入之前就已經顯