以細(xì)小色矛線蟲為模型動(dòng)物的環(huán)境雌激素活體篩選.pdf

1、目前，已建立的較成熟環(huán)境雌激素快速篩選方法主要包括離體篩選和活體篩選兩大類，離體篩選快速、便捷；活體篩選更能反映環(huán)境雌激素對生物體的效應(yīng)及其機(jī)制，一般認(rèn)為結(jié)果更可靠。因此活體動(dòng)物模型篩選方法相比較而言具有更大的實(shí)踐意義。應(yīng)用較廣的活體篩選模型動(dòng)物為鼠和魚類，但其存在實(shí)驗(yàn)周期較長，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高等缺點(diǎn)，而選擇自由生活海洋線蟲作為模式生物便可以解決這一問題。自由生活海洋線蟲(Free-living marine nematode)是線蟲動(dòng)物門(

2、Nematode)的一個(gè)重要組成部分，其種類繁多且分布廣泛，從濱海潮間帶的高潮線到深海大洋的最深海溝，以及從寒冷的兩極到深海脊上的高溫?zé)崛扯加兴鼈兊姆植肌＜?xì)小色矛線蟲(Chromadorina germanica)具有個(gè)體小、生活史短(14d)、雌雄異體、行兩性繁殖的特征，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)培養(yǎng)，已在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單種連續(xù)培養(yǎng)90多代。
　　 卵黃原蛋白(Vitellogenin, VTG)是檢測環(huán)境雌激素的重要生物標(biāo)志物，其分

3、子水平上的指標(biāo)--雄性魚類VTG mRNA是一種靈敏度高、特異性好的生物標(biāo)志物。以VTG mRNA為生物標(biāo)志物的環(huán)境雌激素篩選方法主要包括實(shí)時(shí)定量PCR、Northem雜交、原位雜交等。其中，原位雜交(in situ hybridization)是一種使用標(biāo)記的核酸探針來檢測與其互補(bǔ)的靶核酸在細(xì)胞或組織中的位置的技術(shù)，不但免除了從組織中提取RNA的步驟，還可以準(zhǔn)確地反映出VTG mRNA在組織甚至生物整體樣本中的位置及狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更

4、為直觀。
　　 久效磷農(nóng)藥是一種高效的有機(jī)磷殺蟲劑，其使用殘留對水生生物和人類健康具有潛在的威脅。邴欣等研究表明久效磷農(nóng)藥能夠誘導(dǎo)雄性金魚合成和分泌卵黃原蛋白，是一種環(huán)境雌激素。因此，本文擬通過使用原位雜交手段，檢測在內(nèi)源性雌激素(E2)和環(huán)境雌激素（久效磷農(nóng)藥）的誘導(dǎo)下細(xì)小色矛線蟲VTG mRNA的表達(dá)，初步探討了選用細(xì)小色矛線蟲為研究對象、VTG mRNA為分子水平的生物標(biāo)志物構(gòu)建環(huán)境雌激素活體篩選模型的可行性。
　　

5、 主要研究結(jié)果如下：
　　 設(shè)計(jì)了擴(kuò)增細(xì)小色矛線蟲VTG基因的兼并引物，通過PCR和RT-PCR的方法，獲得了長度為525bp的一段核苷酸序列。通過在NBCI網(wǎng)站上和生物軟件DNAman里分析比對，初步認(rèn)定這段核酸是細(xì)小色矛線蟲vit-6的部分序列。
　　 根據(jù)所獲得的細(xì)小色矛線蟲vit-6的部分序列，設(shè)計(jì)了針對細(xì)小色矛線蟲VTG mRNA的寡核苷酸探針，并用地高辛標(biāo)記，應(yīng)用此探針進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，證明了探針可與線蟲體

6、內(nèi)VTG mRNA發(fā)生特異性結(jié)合。
　　 在此寡核苷酸探針序列的基礎(chǔ)上，合成了熒光素5-FAM直接標(biāo)記的探針，進(jìn)行了靈敏度更高的熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，不僅進(jìn)一步驗(yàn)證了探針與VTG mRNA的特異性結(jié)合力，還顯示出雄蟲體內(nèi)VTG mRNA的合成量隨著環(huán)境雌激素暴露濃度的加大有微弱的上升趨勢。
　　 綜上，以克隆出的C. germanica VTG基因片段為模板設(shè)計(jì)并制備寡核苷酸探針，通過原位雜交的技術(shù)手段，能有效地檢測出環(huán)境雌