靈芝原生質(zhì)體制備再生與遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

1、靈芝原生質(zhì)體制備、再生及遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展?徐鵬，丁重陽，錢竹，章克昌（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室生物資源與轉(zhuǎn)化研究室江蘇無錫214036）摘要:靈芝具有極高的藥用價值和食用價值，本文從靈芝原生質(zhì)體制備、再生以及遺傳轉(zhuǎn)化的方法等方面來闡述有關(guān)靈芝遺傳改造的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞:靈芝（Ganodermalucidum）；原生質(zhì)體；制備再生；遺傳轉(zhuǎn)化AdvanceInThePreparation﹑RegenerationGe

2、icTransfmationOfGanodermaProtoplastXUPengDINGZhongyangQIANZhuZHANGKeChang(LabatyofBiomassBiotransfmationKeyLabatyofIndustrialBiotechnologyMinistryofEducationSouthernYangtzeUniversityWuxi214036China)Abstract:Ganodermaluci

3、dumisfamousfitsmarvelousfunctionasamedicinalediblefungus.Thispaperfocusontheadvanceinthepreparation、regenerationgeictransfmationofGanodermaprotoplastinwhichthegeicmodificationappliedprospectofthisfungusarediscussed.Keywd

4、s:GanodermalucidumProtoplastPreparationregenerationGeictransfmation中圖分類號：Q939.5文獻(xiàn)標(biāo)記碼：A文章編號：傳統(tǒng)中藥靈芝（GanodermalucidumKarst），始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為歷代用藥的上品。有“扶正固本”的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)大量的藥理和臨床實驗證明：靈芝的藥效十分廣泛，且?guī)缀鯚o毒副作用。靈芝在提高機體免疫力、抗腫瘤、抗HIV病毒以及在治療肝炎、腎

5、炎和心腦血管疾病方面表現(xiàn)出顯著的療效[1]，已引起國際醫(yī)學(xué)界的日益重視。作為一種重要的食藥兼用的大型真菌，靈芝的現(xiàn)代研究主要集中于液體深層發(fā)酵技術(shù)以及主要生理活性成分（靈芝多糖、靈芝三萜酸）的研究。而有關(guān)靈芝遺傳背景的報道甚少，原因可能為高等真菌的分子遺傳學(xué)研究開展較晚。最早關(guān)于絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化始于1973年（Mishra和Tatum對Neurospacrassa的DNA轉(zhuǎn)化實驗），此后關(guān)于高等真菌基因工程的研究日益深入。據(jù)李剛等人統(tǒng)

6、計，至今已有60多種食用菌的原生質(zhì)體得到了分離培養(yǎng)[2]。國內(nèi)外對于靈芝原生質(zhì)體制備、再生、融合以及遺傳轉(zhuǎn)化方面已有多篇報道，為通過基因工程手段定向改良靈芝，進(jìn)一步發(fā)揮靈芝的藥用價值奠定了基礎(chǔ)。以下將從靈芝原生質(zhì)體制備、再生的影響因素以及遺傳轉(zhuǎn)化的方法等方面來闡述有關(guān)靈芝遺傳改造的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景。1靈芝原生質(zhì)體制備與再生的研究有關(guān)食用菌原生質(zhì)體的大規(guī)模研究是近十年的事情，從而為以原生質(zhì)體為媒介的生物技術(shù)提供了極大的可能性[2]。靈芝

7、具有重要的藥用價值，其原生質(zhì)體的研究工作已全面開展，為靈芝的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。高效的原生質(zhì)體分離和再生系統(tǒng)是遺傳轉(zhuǎn)化成敗的關(guān)鍵[3]，以下將從材料培養(yǎng)、菌絲預(yù)處理、酶解細(xì)胞壁、滲透壓穩(wěn)定劑、再生培養(yǎng)等方面來闡述各種因素對靈芝原生質(zhì)體制備和再生的影響。1.1材料培養(yǎng)一般是將靈芝從PDA斜面保藏培養(yǎng)基接種至液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)的目的是獲取大量分散的健壯菌絲，以利于酶解細(xì)胞壁及原生質(zhì)體的高效收獲。菌絲培養(yǎng)時靜止培養(yǎng)要優(yōu)于震蕩培養(yǎng)（震蕩培

8、養(yǎng)時會形成大量較致密的菌球，不利于與酶的接觸，從而使得原生質(zhì)體制備率下降）；另外可將培養(yǎng)瓶中加入一定量的無菌小玻璃球，通過每日搖打可將菌絲打散，以提高原生質(zhì)體的制備率[24]。根據(jù)多篇報道，菌齡的選取以40～48小時為宜[256]，也有報道將菌齡延長至4～6天[7]。由于不同菌種的生理生化及生長速度不同，因此高效收獲原生質(zhì)體的菌齡亦不相同，一般以對數(shù)生長期的幼嫩菌絲酶解制備原生質(zhì)體效果最好[5]。及濃度可能不同，需根據(jù)實驗作出具體判斷。

9、1.5再生培養(yǎng)再生培養(yǎng)以獲取原生質(zhì)體最大的再生率為目的。再生培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求豐富，以促使原生質(zhì)體細(xì)胞壁的盡快復(fù)原；再生培養(yǎng)基需要添加滲穩(wěn)劑；轉(zhuǎn)入外源基因的原生質(zhì)體需要在相應(yīng)的選擇性再生培養(yǎng)基上篩出。常用的靈芝原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基有纖維二糖再生培養(yǎng)基[28]、麥芽糖再生培養(yǎng)基[37]以及土豆再生培養(yǎng)基[569]，也有用普通的蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基的[15]。再生培養(yǎng)方式對原生質(zhì)體的再生亦有顯著的影響。李剛等人的報道采用雙層瓊脂培養(yǎng)法（上層0.2

10、%瓊脂下層1.5%瓊脂）可大幅度提高原生質(zhì)體的再生率[28]。據(jù)報道的數(shù)據(jù)來看，靈芝原生質(zhì)體的再生率從千分之幾到幾十不等。2基于靈芝原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的研究基于靈芝原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化已有數(shù)篇報道[34101318]，以下將闡述有代表性的三類遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。2.1以PEG法介導(dǎo)的靈芝轉(zhuǎn)化系統(tǒng)PEG轉(zhuǎn)化法是通過PEG的介導(dǎo)作用，將目的基因?qū)胨拗髟|(zhì)體中的方法，廣泛應(yīng)用于絲狀真菌的轉(zhuǎn)化以及原生質(zhì)體融合的研究中[511]。PEG轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點是操

11、作簡單，外源基因可以穩(wěn)定整合入受體基因組中（機理尚不清楚），缺點是轉(zhuǎn)化效率較低。李剛等人（2004）構(gòu)建了真菌表達(dá)質(zhì)粒pAN71（6.7kb），攜帶有大腸桿菌hph（潮霉素磷酸脫氫酶）基因及構(gòu)巢曲霉gpd（3磷酸甘油醛脫氫酶）基因的啟動子，可在真菌中表達(dá)Hmb（潮霉素HygromycinB）抗性[3]，用60%PEG4000成功實現(xiàn)了對靈芝原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化效率為5～6個抗性轉(zhuǎn)化子（g質(zhì)粒107個原生質(zhì)體），經(jīng)5次以上傳代實驗證明轉(zhuǎn)化

12、子是穩(wěn)定的。經(jīng)PCRSouthernblot以及Southernblot方法證實外源質(zhì)粒已經(jīng)整合入靈芝受體細(xì)胞的基因組中。為PEG法轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體奠定了基礎(chǔ)。2.2以電穿孔法介導(dǎo)的靈芝轉(zhuǎn)化系統(tǒng)電穿孔法是細(xì)胞或原生質(zhì)體在瞬時脈沖高壓電場下，質(zhì)膜被擊穿，使得外源大分子DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。與PEG法相比，電穿孔法轉(zhuǎn)化效率較穩(wěn)定，但仍有轉(zhuǎn)化效率低的缺點[11]。Sunet.al.（2001）建立了靈芝原生質(zhì)體的電穿孔轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[4]。他們

13、分離出香菇（Lentinusedodes）gpd（3磷酸甘油醛脫氫酶）基因的啟動子，并與來自S.hygroscopicus的bar基因(作為選擇性標(biāo)記表達(dá)bialaphos抗性)整合，再分別與來自大腸桿菌的gus(β葡萄糖醛酸酶)基因和來自A.victea的gfp（綠色熒光蛋白GFP的一種突變基因）基因相連接構(gòu)建成質(zhì)粒p301bG1（9.0kb）和p301bg（7.8kb），實現(xiàn)了外源基因gus和gfp的表達(dá)。由于gus基因和gfp基因

14、本身可作為報告基因，因此Sunetal.的研究為靈芝的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)開辟了一條新的途徑。Sunetal.的電穿孔條件為：場強2.5kvcm；電容量25μF；電阻400Ω。最終的轉(zhuǎn)化效率為15個轉(zhuǎn)化子（g質(zhì)粒DNA）。經(jīng)斑點雜交（地高辛—dUTP標(biāo)記gus和gfp基因的探針）分析，證實gus和gfp基因成功整合入靈芝基因組中，并獲得了組成型表達(dá)。張新濤等人（2001）構(gòu)建了質(zhì)粒pBSβgeo，將βgal（β半乳糖苷酶）和neo（胭脂堿合成酶