mirrna的定量實(shí)驗(yàn)方案

1、1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模篟D細(xì)胞定量檢測(cè)miR188miR6572、實(shí)驗(yàn)材料及試劑：超凈臺(tái)（上海凈化設(shè)備廠(chǎng)）生物安全柜（ESCO，Singape）細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus，Germany）分光光度儀（Eppendf，Germany）PCR儀（Eppendf，Germany）冷凍離心機(jī)（Eppendf，Germany）移液槍?zhuān)‥ppendf，Germany），（realtime試劑盒（takara），顯微(coic重慶光學(xué)儀器廠(chǎng)），計(jì)數(shù)板；異丙醇

2、（上?；瘜W(xué)試劑有限公司），八連管；100%乙醇（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）細(xì)胞培養(yǎng)液（Gibco，USA），氯仿（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）EDTA胰酶（Gibco，USA）Trizol（Invitrogen，USA）三、實(shí)驗(yàn)過(guò)程（1）RD細(xì)胞的收集1.培養(yǎng)傳代RD細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，密度約80%時(shí)進(jìn)行收集；2..倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1ml的胰酶于培養(yǎng)瓶中，混勻后將其吸掉（防止消化過(guò)度)靜置，在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞開(kāi)始變圓（細(xì)胞成流沙狀流下時(shí)

3、）；.加入1ml的培養(yǎng)液，吹打混勻，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照公式（四個(gè)大方格4)104稀釋的倍數(shù)=細(xì)胞原液量ml.記錄數(shù)據(jù)。取出200ul的該細(xì)胞懸液于經(jīng)DEPC處理的EP管中。（2）Trizol抽提總RNA1.取出上步所收集到的細(xì)胞懸液。2.加入1mlTrizol，顛倒34次，室溫靜置10min。3.每1mlTrizol加入0.2ml氯仿劇烈震蕩15sec，室溫放置5min。4.4℃，12000g低溫離心15min，此時(shí)樣品分為三層：上

4、層為無(wú)色水相，中間層為白色底層為黃色有機(jī)相。5.吸約650ul的上清液于新的Eppendf管。6.加入等體積650ul的異丙醇，顛倒混勻，室溫下20min(20℃沉淀1小時(shí)以上)。7.4℃，12000g低溫離心15min。8.去上清，加入1ml75%乙醇，4℃，10000g低溫離心8min，重復(fù)一次。9.倒掉乙醇，自然晾干，不可用太大力；室溫放置5～10min干燥RNA沉淀。10.用含有1UμlRNA酶抑制劑的水20μl溶解。11.收集

5、標(biāo)記提取出的RNA待用；（3）RT1.注意：做之前要用分光光度儀測(cè)定RNA的量；水的量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況來(lái)加，使得最后反應(yīng)體系是10ul。在此步的同時(shí)要做內(nèi)參5sRNA的逆轉(zhuǎn)錄3.要用到六排八連管，每三排為一組，分別測(cè)定miR188a3p和miR657。樣本做兩排，做復(fù)孔，每一排的第一孔加水做陰性對(duì)照；前兩排的其余七孔按照上圖稀釋的倍數(shù)按順序加入不同稀釋度的樣本反應(yīng)液；第三排的其余七孔加內(nèi)參5sRNA的不同稀釋度的反應(yīng)液，同樣的順序。