南京醫(yī)科大學(xué)-現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述

1、現(xiàn) 代 實(shí) 驗(yàn) 技 術(shù) 概 述,南京醫(yī)科大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)研究所 辜 楠,研 究 思 路,整 體（動(dòng)物模型、ELISA ） 組 織、細(xì) 胞（組織、細(xì)胞培養(yǎng)） 分 子（RNA、DNA、Protein）

2、 基 因（基因克?。?,,,,,整 體 研 究,動(dòng)物模型自發(fā)性動(dòng)物模型（Spontaneous Animal Models）是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處置，在自然情況下所發(fā)生的疾病。這類模型在遺傳病、代謝病、免疫缺陷病、內(nèi)分泌疾病和腫瘤等方面的應(yīng)用正日益增多。 誘發(fā)性或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物模型（Experimental A

3、nimal Models）是指研究者通過使用物理的、化學(xué)的和生物的致病因素作用于動(dòng)物，造成動(dòng)物組織、器官或全身一定的損害，出現(xiàn)某些類似人類疾病時(shí)的功能、代謝或毒使動(dòng)物患相應(yīng)的傳染病，又如用化學(xué)致癌劑、放射線、致癌病毒誘發(fā)動(dòng)物的腫瘤等。是藥物篩選研究工作所首選。,,整 體 研 究,ELISA—酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ）原理: 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加

4、入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例，由此進(jìn)行定性或定量分析。,,ELISA,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即“免疫吸附劑” （immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）（3）酶反應(yīng)的底物。,,ELISA,雙抗體夾心法測(cè)抗原,,雙抗原夾心法測(cè)抗體,組織、細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)：

5、將取得的組織、細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。 理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。,,組織、細(xì)胞培養(yǎng),組織塊培養(yǎng)：直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)：一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接

6、入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。,,培養(yǎng)條件,完全培養(yǎng)基：由基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如MEM）和添加劑（如血清或無血清培養(yǎng)用的某些確定的激素及生長(zhǎng)因子）組成。 條件：37度、5％CO2、合適的PH 關(guān)鍵：無菌,,,CO2培養(yǎng)箱,免疫組織化學(xué),基本原理 用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理和特殊的標(biāo)記技術(shù)，對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，經(jīng)過組織化學(xué)的顯色反應(yīng)之后

7、，用顯微鏡、熒光顯微鏡或電鏡觀察。 免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）技術(shù)在細(xì)胞、染色體或亞細(xì)胞水平原位檢測(cè)抗原分子，是其它任何生物技術(shù)難以達(dá)到和代替的。它能在細(xì)胞、基因和分子水平同時(shí)原位顯示基因及其表達(dá)產(chǎn)物，形成了新的檢測(cè)系統(tǒng)，為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和各個(gè)領(lǐng)域分子水平的研究與診斷，開拓了廣闊的前景。,,分子水平研究,轉(zhuǎn)錄 翻譯 DNA

8、RNA Protein 逆轉(zhuǎn)錄 中 心 法 則,,,,,,,,核酸提取,分類：DNA 主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量 DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA RNA 存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNA等非細(xì)胞形式存在的病毒和噬

9、菌體（或只含DNA，或只含有RNA）,,核酸制備步驟,,,破碎細(xì)胞,提 取,純 化,,,總RNA的提取,RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑： 1)提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來； 2)直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性,,TRIZOL 法,TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。氯

10、仿離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。異丙醇沉淀還原水樣層中的RNA。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。,,完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提,DNA的提取,從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同

11、。對(duì)于低等生物如從病毒中提取DNA 比較容易，多數(shù)病毒DNA 分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。從細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。細(xì)菌DNA 分子量較大，一般達(dá)2×10 道爾頓。因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌DNA，除核DNA 外，還有質(zhì)粒DNA 等。,,全血DNA的提取,原理：在全血或骨髓樣本中分離DNA時(shí)，不含DNA的紅細(xì)胞首先被裂解繼而從白細(xì)胞中分離。在DNA穩(wěn)定劑（抑制細(xì)胞內(nèi)和環(huán)境中的DNase活性）存

12、在時(shí)用一種離子去污劑即可從體液或微生物血細(xì)胞、動(dòng)物組織細(xì)胞等細(xì)胞中分離DNA。RNA酶可去除RNA污染。其它污染物如蛋白質(zhì)可通過鹽沉淀來去除。乙醇沉淀并在含有DNA穩(wěn)定劑的緩沖液中溶解從而得到基因組DNA。,,蛋白質(zhì)提取,基本步驟： 清洗組織/細(xì)胞（緩沖鹽液） 裂解細(xì)胞（裂解液） 離心去除膜組分等獲得可溶性蛋白質(zhì) 純化（離心、層析、電泳等）,,

13、,,,電 泳,概念：帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。原理：在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng 的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此

14、外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。,,聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。 對(duì)于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。 瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb 的DNA片段。其分辨率比聚丙烯酰胺凝膠低

15、，但制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段DNA。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。,,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。 聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)。用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高。 聚

16、丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。,,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,,1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。 2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-

17、HCl緩沖液。 3.在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度 在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。,,,,,,,,,,,,,,,,,,8.3,8.3,8.9,6.7,,水平板式電泳槽,垂直板式電泳槽,反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reversetranscription-Polymerase chain reaction） 抽提RNA

18、 總RNART cDNAPCR DNA Analysis:Quantification or cDNA clone,,,,,RT－PCR,RT－逆轉(zhuǎn)錄,定義：以信使RNA（mRNA)為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成cDNA(基因)。 逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV、M-MLV) mRNA cD

19、NA,,,,,PCR－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因或DNA片段。原理：類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制 在試管中的DNA的體外合成。用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。,,◆,◆,◆,,,,引物1,引物2,模板,PCR原理示意圖,,目的基因增加2n,20～30循環(huán),94℃變性,5’ 3’,3’ 5’,,,變性94℃,引物,,退火45-65 ℃,延

20、伸72 ℃,PCR過程示意圖,模板,,,,,PCR反應(yīng)產(chǎn)物積累規(guī)律示意圖,平臺(tái)期,產(chǎn)物量,時(shí)間（循環(huán)數(shù)）,PCR反應(yīng)五要素,引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）,,實(shí)時(shí)熒光定量PCR,常規(guī)PCR：借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信

21、號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對(duì)起始模板的定量分析,,,,,,,,淬滅基團(tuán),R,,,,,,熒光定量PCR示意圖,,模板DNA,DNA探針,R,,,Q,Q,報(bào)告基團(tuán),Western Blotting,§印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。§1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并

22、利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。§而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。,,Western Blotting,蛋白質(zhì)分離：十二烷基磺酸鈉―聚丙烯酰 胺凝膠電泳（SDS－PAGE）蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)?。旱鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)

23、移到硝酸纖維素膜（NC）上，稱為一個(gè)印跡（blot）固相免疫測(cè)定(ECL)：一抗、酶標(biāo)二抗、底物,,Northern Blotting,RNA片段經(jīng)電泳后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后用探針雜交。被檢對(duì)象為RNA,探針為DNA 或RNA。應(yīng)用：檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平。比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。,,提取RNA,瓊脂糖凝膠變性電泳,堿變性、轉(zhuǎn)移到NC膜,與DNA或RNA探針雜交,放射

24、自顯影,Northern印跡雜交,Northern Blotting,RNA分離：瓊脂糖凝膠變性電泳（去除RNA 中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證RNA 完全按分子大小分離）RNA轉(zhuǎn)?。篟NA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上探針雜交X 光片進(jìn)行放射自顯影,,pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heart,GEF mRNA,Northern blo

25、tting hybridization,基 因 克 隆,基因克?。ǚ肿涌寺olecular cloning）應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子、重組體），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝，或其表達(dá)產(chǎn)物。,,基因克隆示意圖,基本步驟,提取目的基因:人工基因合成法(RT-PCR)目的基因與載體結(jié)合:限制性內(nèi)切酶、

26、DNA連接酶將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞:轉(zhuǎn)化目的基因的檢測(cè)和表達(dá):,,載體（Vector）：是指運(yùn)載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。 限制性核酸內(nèi)切酶：切割DNADNA連接酶：生成3’－5’磷酸二酯鍵,原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）、噬菌體（λ，M13）真核載體：動(dòng)物病毒載體pLXSN,謝謝,Question ？,Resistin ＆Polycystic ovary syndrome (PCOS