登革病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)精美自制

1、登革病毒實(shí)驗(yàn)室診斷,,登革病毒的概述,黃病毒科黃病毒屬 單股正鏈RNA登革病毒 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個血清型形態(tài)結(jié)構(gòu)　　球形，直徑37nm～50nm 含單股正鏈RNA，長度約11Kb 編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，7種非結(jié)構(gòu)蛋白5’-C-PrM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’3’端非編碼區(qū)含高度保守的核苷酸序列宿主范圍　　3種自然宿主：伊蚊、人

2、、低等靈長動物,,,登革病毒成熟顆粒模擬圖,普通登革熱： 登革熱(dengue fever)是由登革熱病毒所引起，由伊蚊傳播的急性傳染病。其臨床特征為突起發(fā)熱，頭痛，全身肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)痛，極度疲乏，皮疹，淋巴結(jié)腫大及白細(xì)胞減少，部分病人有出血傾向，病情較輕，通?？勺孕谢謴?fù)。 登革出血熱： 病情較重，致死率高。通常發(fā)生于過去已感染過登革病毒而再次感染其他型別的人，發(fā)病的嚴(yán)重程度與病人血清原來存在的登革病毒抗體密切關(guān)系。

3、登革休克綜合癥：,全球形勢,DF廣泛分布于有媒介伊蚊存在的熱帶、亞熱帶地域。在東南亞、西太平洋和加勒比海地區(qū)呈現(xiàn)地方性流行。世界衛(wèi)生組織警告登革熱病例正在迅猛增加已威脅到全球三分之一人口的健康安全WHO估計(jì)，全球約25億的人群處于DF的威脅中。全球每年有5000萬人感染登革熱病毒，其中50萬為DHF病例（其中大部份為兒童）。目前全世界還沒有有效的疫苗預(yù)防登革熱。,埃及伊蚊,白紋伊蚊,在東南亞及海南省，埃及伊蚊是本病的主要媒介

4、。在廣東、廣西，白紋伊蚊是主要媒介。白紋伊蚊孳生于房屋內(nèi)外的淺水及積水中。成蚊白天吸血，嗜人血。,傳 播 媒 介,流行病學(xué),患者和隱性感染者是主要傳染源 。在流行期間，隱性感染者的數(shù)量可達(dá)全體人群的1/3，可能是最重要的傳染源。主要發(fā)生于市鎮(zhèn)人口集中地區(qū)，發(fā)病與布雷指數(shù)有關(guān)。雨季為發(fā)病高峰季節(jié)。廣東省5~10月流行。其中8、9月份為高峰。有一定的周期性（4－5年）。人與人之間不會直接經(jīng)過呼吸道、消化道或接觸等傳播。人

5、群易感性和免疫力 人對登革病毒普遍易感，但感染后并非人人發(fā)病。由于對不同型別毒株感染無交叉免疫力，因此可以發(fā)生二次感染。感染一種病毒型產(chǎn)生的免疫對同型病毒免疫力可持續(xù)1～4年，而對異型病毒的免疫則短。,登革熱流行與預(yù)防,有利于DF流行的因素登革病毒（帶毒蚊、人、獸）輸入輸入地自然氣候輸入地伊蚊密度、 屋內(nèi)處積水容器、 居民養(yǎng)花、養(yǎng)蓮、 建筑工地積水、水缸積水預(yù)防登革熱健康提醒：1.到登革熱流行區(qū)旅游或生活，應(yīng)穿

6、著長袖衣服及長褲，并在外露的皮膚及衣服上涂蚊蟲驅(qū)避藥物；2.如果房間沒有空調(diào)設(shè)備，應(yīng)裝置蚊帳或防蚊網(wǎng)；3.使用家用殺蟲劑殺滅成蚊，并遵照包裝指示使用適當(dāng)?shù)姆至浚?.避免在“花斑蚊”出沒頻繁時段在樹蔭、草叢、涼亭等戶外陰暗處逗留；5.防止積水，清除伊蚊孳生地；6.盡量避免用清水養(yǎng)植植物；7.對于花瓶等容器，每星期至少清洗、換水一次，勿讓花盆底盤留有積水。把所有用過的罐子及瓶子放進(jìn)有蓋的垃圾桶內(nèi)。,實(shí)驗(yàn)室確診病例,普通登革熱：

7、登革病毒血清特異性IgM抗體陽性，結(jié)合臨床癥狀恢復(fù)期血清特異性IgG抗體比急性期有4倍以上增長從急性病人血清、腦脊液或尸解臟器中分離到病毒或檢測到病毒序列或檢測到病毒抗原登革出血熱：多器官大量出血肝腫大血容比增加20％以上登革休克綜合癥：伴休克,登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測常規(guī)方法,C6/36細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)登革病毒的分離和鑒定血凝抑制試驗(yàn)（HI）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）中和試驗(yàn)（NT）間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

8、（ELISA）膠體金免疫層析快速診斷試驗(yàn) 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn) (DIBA )RT-PCR熒光PCR,標(biāo)本的采集與保存,采集對象 主要為登革熱疑似病例、臨床診斷病例等，必要時采集疑似病例的密切接觸者標(biāo)本。根據(jù)采樣時間確定檢測目的病原學(xué)檢測 初次感染： 出現(xiàn)登革熱癥狀的前1～2和發(fā)病后的3～5天 再次感染： 出現(xiàn)登革熱癥狀的前后1～2天血清學(xué)檢測　初次感染：　出現(xiàn)登革熱癥狀

9、1周后可檢測到IgM;2周后可檢測到IgG 再次感染：　出現(xiàn)登革熱癥狀后1～2天可檢測到IgM和IgG,,,標(biāo)本的采集與保存,蚊媒標(biāo)本主要為埃及伊蚊、白紋伊蚊或其它可疑蚊種，檢測抗原，常用于登革病毒監(jiān)測。采集回來的蚊子置－20℃凍死后，按蚊種及捕獲地點(diǎn)分組，以每組20～50只分裝于螺口凍存管，－70ºC冰箱或液氮保存。蚊媒標(biāo)本的檢測目的是登革病毒分離或登革病毒核酸檢測，因此標(biāo)本采集后應(yīng)確保存于超低溫條件下。,

10、蚊蟲標(biāo)本研磨程序,一組標(biāo)本（50只蚊子）轉(zhuǎn)入1.5ml 的eppendorf離心管加入100µl標(biāo)本處理液用小型電動研磨器將蚊子磨勻補(bǔ)加900µl標(biāo)本處理液4ºC，10000rpm，離心10min,,,,,,標(biāo)本處理液:MEM 　 90ml 小牛血清 2 ml 慶大霉素（50µg/ml)100µl兩性霉素B（1000µg/ml）1ml青鏈霉素（1000U/m

11、l） 　1ml用7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)至PH7.2。 用于： 登革病毒分離 登革病毒核酸檢測剩余的研磨液需保存在-70ºC冰箱中以備復(fù)查。,注意：研磨過程最好在冰上操作； 低溫離心機(jī)4℃,標(biāo)本的采集與保存,血液標(biāo)本是登革病毒檢測的主要標(biāo)本，采集5ml為宜，血清、血漿都可，可檢測抗原或抗體。用于抗體檢測的血清標(biāo)本最多可在2～8℃保存一周，長期保存應(yīng)在－20℃以下。用于抗原檢測的血清標(biāo)本應(yīng)保存于－7

12、0 ℃。全血冰凍溶解后會產(chǎn)生溶血，未分離血清的標(biāo)本應(yīng)避免冰凍保存。,感染登革病毒后的免疫反應(yīng),采集第二份血的重要性,1～7天，70～80％核酸陽性，晚恢復(fù)期血清（14－30天）抗體檢測可進(jìn)一步確認(rèn)可分辨初次和二次感染對于初次感染，晚恢復(fù)期血清可用以型別鑒定,檢測方法的選擇,≤5天 急性期，3種方法8～13天 早恢復(fù)期 14～30天 晚恢復(fù)期病毒分離 7天

13、 抗體檢測 3小時病毒核酸檢驗(yàn) 2-3小時,,血清抗體檢測,登革病毒的分離和鑒定,所用樣本急性期血清、血漿、淋巴細(xì)胞尸體組織：尤其是肝、脾、淋巴結(jié)、胸腺蚊子樣本的保存48小時內(nèi)進(jìn)行病毒分離，可放于4－8℃存放時間較長，應(yīng)把血清分離出來，－70 ℃保存，避免凍融淋巴細(xì)胞，抗凝血應(yīng)在幾小時內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室分離方法：敏感細(xì)胞分離、乳鼠接種分離、蚊蟲接種分離。常用C6/36細(xì)胞進(jìn)行登

14、革病毒分離。鑒定方法：　中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、單克隆抗體免疫熒光技術(shù)、PCR技術(shù)。,病毒分離,1.接種到蚊頭(最敏感)2.接種敏感細(xì)胞：C6/36，BHK21（成本效益最高）3.接種乳鼠鑒定方法：　中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、單克隆抗體免疫熒光技術(shù)、PCR技術(shù)。,C6/36細(xì)胞分離登革病毒,單層C6/36細(xì)胞的準(zhǔn)備（ C6/36細(xì)胞通常28℃培養(yǎng)2～3天后可長成單層，

15、7～10天傳下一代。 C6/36細(xì)胞形態(tài)為類圓形，易于貼壁生長，但貼壁不牢。 C6/36細(xì)胞是傳代細(xì)胞，理論上可以無限傳代。）　細(xì)胞管法、細(xì)胞板法標(biāo)本的處理　血清標(biāo)本、蚊蟲標(biāo)本和組織標(biāo)本 標(biāo)本接種　接種、吸附、細(xì)胞毒性的處理結(jié)果觀察　每天觀察細(xì)胞生長情況,正常C6/36細(xì)胞（100X）,C6/36細(xì)胞接種病人血清第二天時出現(xiàn)的血清毒性現(xiàn)象（100X）,細(xì)胞培養(yǎng)分離登革病毒,登革1型病毒在C6/36細(xì)胞上病變

16、情況（100X）,登革2型病毒在C6/36細(xì)胞上病變情況（100X）,登革3型病毒在C6/36細(xì)胞上病變情況（100X）,登革4型病毒在C6/36細(xì)胞上病變情況（100X）,血凝抑制試驗(yàn),血凝試驗(yàn),血凝抑制試驗(yàn),有血凝素（HA）的病毒能凝集人或動物紅細(xì)胞，稱為血凝現(xiàn)象，血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體抑制稱為血凝抑制試驗(yàn)，原理是相應(yīng)抗體與病毒結(jié)合后，阻止病毒表面HA與紅細(xì)胞結(jié)合，使原有的血凝反應(yīng)被抑制。過去最常規(guī)的方法，優(yōu)點(diǎn)：敏感容易操作，需要

17、的儀器少，結(jié)果可靠，HI抗體可存在30～45年；缺點(diǎn)：樣本要預(yù)處理，必須雙份血，難以區(qū)分登革病毒感染和其他黃病毒感染（如乙腦病毒、西尼羅病毒等） 。,補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),抗體與抗原反應(yīng)形成復(fù)合物，通過激活補(bǔ)體而介導(dǎo)溶血反應(yīng)，可作為反應(yīng)強(qiáng)度的指示系統(tǒng)。沒有廣泛應(yīng)用，操作較難，可用于檢測現(xiàn)感染，不適用于血清流行病學(xué)研究。,中和試驗(yàn)（NT）,優(yōu)點(diǎn)：最特異和敏感的方法缺點(diǎn)：昂貴，耗時長，技術(shù)復(fù)雜，不常用,間接免疫熒光試驗(yàn),,,,,,,,,,,,

18、,,,,抗原,抗體,熒光標(biāo)記抗抗體,原理：,缺點(diǎn)：需要熒光顯微鏡，和富有經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)人員,快速檢測試劑,全血、血清、血漿含所有檢測所需物品儲存溫度 (2 - 30°C) >90% 敏感性和特異性15 分鐘出結(jié)果可鑒別初次和二次感染25 tests,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),,,酶標(biāo)記登革病毒單抗與登革病毒復(fù)合物,人IgM抗體,抗人IgM單克隆抗體,捕捉法（檢測登革病毒抗體IgM）,IgM抗體出現(xiàn)的比IgG早一點(diǎn),約

19、5天后可以查到。初次感染的IgM比二次感染高的多，IgM可持續(xù)2～3個月診斷意義：IgM陽性不表明現(xiàn)感染，有可能是2～3個月前感染，在登革尚未地方性流行地區(qū)，可用于臨床檢測和人群監(jiān)測,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接法(檢測登革病毒抗體IgM或IgG),1. 酶標(biāo)板孔上包被登革病毒抗原,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2. 每孔中加血清標(biāo)本稀釋液 （如果含登革病毒抗體IgM或IgG即可結(jié)合）,,,,,,,,,,,,,,,

20、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3. 加HRP標(biāo)記的二抗（抗人IgM或抗人IgG），在適當(dāng)?shù)牡孜镒饔孟鲁尸F(xiàn)顏色反應(yīng),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

21、,,,,,,,,,,,,,4. 肉眼判斷顏色深淺或加終止液后用酶標(biāo)儀讀取每孔不同的吸光值，初步判斷標(biāo) 本中抗體的含量,IgG 非特異，與其它黃病毒有交叉反應(yīng)，不能用于分型，敏感性比HI好，正取代HI,登革病毒的核酸檢測：PCR檢測與鑒定登革病毒處理流程,血清（細(xì)胞上清或組織研磨液）,病毒RNA提取,cDNA的合成,登革病毒型特異引物PCR擴(kuò)增,凝膠電泳，結(jié)果判斷,,,,,用QIAamp Viral RNA Kit或者R

22、oche Viral RNA Kit提取病毒RNA,根據(jù)PCR特異性產(chǎn)物片段大小進(jìn)行判斷,RT-PCR檢測登革病毒基因與分型登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS216-2008）,500bp,,,500bp,通用引物PCR結(jié)果,分型引物PCR結(jié)果,M IⅡ Ⅲ Ⅳ,M IⅡ Ⅲ Ⅳ,通用產(chǎn)物：511bp 分型產(chǎn)物：

23、 Ⅰ：482bp， Ⅱ：119bp， Ⅲ：290bp，

24、 Ⅳ：392bp,Real time PCR檢測登革病毒處理流程,血清（細(xì)胞上清或組織研磨液）,病毒RNA提取,cDNA的合成,Real timePCR,結(jié)果判斷,,,,,用QIAamp Viral RNA Kit或Roche Viral RNA Kit提取病毒RNA,登革病毒是RNA病毒，PCR前先進(jìn)行RT,根據(jù)Real time PCR后軟件分析得到的擴(kuò)增曲線進(jìn)行判斷,引物與探針的特異性是反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵因素,登革病毒檢測用引物

25、與探針登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS216-2008）,登革病毒通用引物 Den-FP： 5’ GCATATTGACGCTGGGAGAGA　3’Den-RP： 5’GGCGTTCTGTGCCTGGAAT　3’登革病毒通用探針Den-Probe：5’ FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB　3’ 引物和探針均由上海基康生物技術(shù)有限公司合成及標(biāo)記，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。也可用商業(yè)化試劑盒（上海之江生產(chǎn)的登革

26、熱通用性熒光PCR核酸檢測試劑盒）。也可用熒光PCR方法對登革病毒進(jìn)行基因分型（WS216-2008）。,登革病毒基因組序列測定與分析,DNA序列測定是分析某特定基因的結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。登革病毒基因組的序列分析可反映登革病毒基因變異的遺傳信息。通過測定來源于不同時期不同地理區(qū)域不同動物宿主登革病毒株的核苷酸序列，可對登革病毒的分子進(jìn)化史進(jìn)行系統(tǒng)分析。,E基因：中和抗原表位，型特異表位，在登革病毒的致病和免疫中起著至關(guān)重要的作

27、用,歷年深圳市登革熱病例病毒型別,2005年：D2，D42007年：D32008年：D1，D22009年：D2，D32010年：D1（首次本地爆發(fā)疫情）深圳市歷年發(fā)生的登革熱疫情，病毒流行株的E基因序列均可追溯到國外的毒株，提示深圳市的登革熱仍有可能為輸入性的，輸入地主要為東南亞各國。,深圳市登革病毒E基因進(jìn)化分析,登革2型病毒分離株SZ0521的系統(tǒng)進(jìn)化樹,登革4型病毒分離株SZ0524的系統(tǒng)進(jìn)化樹,,疑似登革熱病人發(fā)病內(nèi)血

28、清,接種C6/36細(xì)胞,IgM、IgG ELISA,Real time RT-PCR快速測登革病毒（可選）,IgM和IgG ELISA陰性,IgM或IgG ELISA陽性,Real time RT-PCR或RT-PCR鑒定,陰性盲傳3代仍為陰性,判定登革病毒型別,登革病毒培養(yǎng)陰性,判定為陰性,IgG陽性，IgM很低或陰性,IgM很高，IgG很低或陰性,IgM和IgG陽性，但較低,二次感染,初次感染,IgM和IgG仍保持較低水平