方法學(xué)驗證中各項指標(biāo)的深度剖析上海藥檢所謝沐風(fēng)撰寫

1、方法學(xué)驗證中各項指標(biāo)的深度剖析,謝沐風(fēng) 上海市藥品檢驗所xiemufeng@sina.com,一、線性試驗,主成分含量測定 以測定濃度為100% ，50%~120%之間選取5個點即可。 溶出（釋放）度測定 以釋放量的10%～120%間選取5個點即可。 雜質(zhì)含量用雜質(zhì)對照品準(zhǔn)確測定 以雜質(zhì)限度為100% ，50%~120%之間選取5個點即可。,測定結(jié)果：1）闡述如何看待截距和斜率、如何應(yīng)用。

2、2）誤差在哪里，應(yīng)用時的注意事項。3）為什么沒有不成線性的？通常C、H、O、N結(jié)構(gòu)，紫外監(jiān)測器決定。 個別化學(xué)鍵所致。梯度洗脫時，有時會出現(xiàn)不成線性。4）都成線性、為何還要做？最小二乘法的原理知曉。,唑 來 磷 酸 結(jié) 構(gòu) 式,引申使用：1）有關(guān)物質(zhì)測定 歸一化法和自身對照法的相互妙用。2）緩釋制劑溶出度測定，對照品濃度設(shè)定為中間濃度。舉例說明。3）回收率試驗為何做80%~120%即可？亦及樣品濃度與對照品濃度

3、接近到何等程度的理解。4）國內(nèi)只注重相關(guān)系數(shù)，不注重截距。,二、精密度試驗,重復(fù)性試驗：連續(xù)進樣6次。 中間精密度試驗和重現(xiàn)性試驗通過“耐用性試驗中的溶液穩(wěn)定性試驗”來體現(xiàn)。 濃度極低時才會不理想，加大進樣量。 色譜峰形極為重要，對稱性、柱效等參數(shù)。加大柱溫、增加流動相中有機相比例，使被測物質(zhì)峰盡快出峰。,三、準(zhǔn)確度試驗 用回收率來衡量,作法：在80%~120%間選擇3點或5點，原因是由外標(biāo)一點法決定的。

4、 已知雜質(zhì)、且有雜質(zhì)對照品的，可采用加入法，即加樣回收率來評價。 一般情況下，只要空白輔料無干擾，回收率均是良好的！,四、專屬性,有關(guān)物質(zhì)為主，其他檢測項目（含量）基本上均參照有關(guān)物質(zhì)。 有關(guān)物質(zhì)的驗證，采用中間體和降解產(chǎn)物（確認結(jié)構(gòu)后人工合成）來驗證與主成分的分離。,系統(tǒng)適用性試驗的配制方法： 在100％濃度的主成分溶液中加入1%濃度的雜質(zhì)對照品，以模擬樣品中有可能存在的狀態(tài)。

5、 介紹配制方法 —— 先配制雜質(zhì)貯備液，再用供試品溶液（或濃的對照品溶液）來稀釋，簡便、易行！,專屬性試驗驗證圖譜,存在問題 —— 配制相同濃度，測定樣品時，主成分峰驟然加大，將雜質(zhì)峰覆蓋。 強破壞試驗的目的： 驗證藥品在遭遇了極端的氣候環(huán)境條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)，在所建立的色譜條件下是否能夠分離、測定。,● 檢測波長的確定 涉及到各被檢測物質(zhì)在該波長下的響應(yīng)因子是否相同，即所謂重量校正因子的問題。（f

6、=A雜質(zhì)/A被測成分） 選取主成分與各雜質(zhì)具有相同紫外吸收的波長（f=1.0）。 選取各雜質(zhì)紫外吸收大于主成分紫外吸收的波長（f>1.0），這樣可更加嚴(yán)格控制雜質(zhì)的限度。 如選取各雜質(zhì)紫外吸收小于主成分紫外吸收的波長，應(yīng)必須加入重量校正因子（f<1.0），否則將得到錯誤的判斷。,介紹該項檢測的由來和歷史背景 要看主峰里是否有雜質(zhì)，如何判斷？但需注意DAD檢測器的局限性，介紹“土辦法”

7、！ 結(jié)果：目前從來沒有推翻現(xiàn)行色譜條件的。意義在哪里。如何應(yīng)用，拿到只是“走形式”？,最小峰面積的設(shè)定● 其設(shè)定，不是絕對值，而是相對值。● 英國藥典中有明確的說明：凡有關(guān)物質(zhì)的檢測采用HPLC法測定時，均規(guī)定舍棄對照溶液主峰面積幾分之幾的峰面積。普通樣品測定時，通常為1/10~ 1/20（即相當(dāng)于樣品測定濃度的0.1%~0.05%）。如規(guī)定雜質(zhì)限度為1.0%，對照溶液峰面積為10000，那么，最小峰面積可考慮設(shè)

8、定為1000~500左右。新藥穩(wěn)定性考核時，可設(shè)定到0.01%的最小峰面積。● 原料藥銷售與購買的合同中，為確保雙方達成一致意見，此點應(yīng)予以重視。,強力破壞試驗● 水破壞 取原料適量，加水溶解后，在90℃放置24小時?！?氧化破壞 取原料適量，用5%過氧化氫溶液溶解后，在90℃放置24小時?！?強堿破壞 取原料適量，用1mol/L氫氧化鈉溶液溶解后，在90℃放置24小時?！?強酸破壞 取原料適量，加1mol/L鹽酸

9、溶液溶解后，在90℃放置24小時?！?高溫破壞 取原料適量，依據(jù)各自品種的熔點不同，在高溫下破壞至外觀性狀改變● 強光破壞 取原料適量，置紫外燈下照射48小時。,四、檢測限,● 信噪比的三倍 —— 純屬“紙上談兵”，實際測定中根本用不上?！?是相對值，不是絕對值。是相對于供試品溶液濃度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。,有關(guān)物質(zhì)、含量與自身對照三者濃度的關(guān)系,積分參數(shù)的設(shè)定● 積分參數(shù)的設(shè)定是非常重要

10、的。由斜率(Slope)、峰寬(Width)、最小峰面積(Min Area)組成。● 采用自身對照法時，對照溶液與供試品溶液必須在同一斜率、峰寬下進行積分計算?！?供試品溶液最小峰面積的設(shè)定將直接導(dǎo)致測定結(jié)果。設(shè)定得太小，會導(dǎo)致很多小峰甚至是基線漂移的小峰均被積分出作為雜質(zhì)峰，從而導(dǎo)致雜質(zhì)峰面積增加，易判斷為不合格；如設(shè)定得過大，又將反映不出雜質(zhì)情況。,方法學(xué)認證中的耐受性試驗 是指更換試驗因素，如不同人員、不同儀

11、器，不同色譜柱型號、廠家，不同試劑等因素。這一點才是真正至關(guān)重要的！認證時不可能做到這一點，出現(xiàn)問題時往往要考慮到。,方法學(xué)認證中溶液穩(wěn)定性的全面判定不能單從主成分入手！還要注意所有組分的百分比變化，絕對值變化！,流速、柱溫與溶劑的選擇● 在測定時通常調(diào)節(jié)流速使主成分保留時間稍長些，且使主成分峰不拖尾即可?！?柱溫對分離效果的影響雖有一定的影響，但不甚顯著，如有柱溫箱，通常設(shè)定不超過35℃。● 溶劑的選擇應(yīng)測定樣品溶液在

12、該溶劑中的穩(wěn)定性來衡量，盡量勿選擇揮發(fā)性強的溶劑；同時應(yīng)保證對照溶液的主成分峰面積精密度良好。,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂有關(guān)物質(zhì)的原則● 采用雜質(zhì)對照品法、用于降解產(chǎn)物的準(zhǔn)確測定，如氫氯噻嗪、對乙酰氨基酚等。● 采用強破壞試驗破壞出雜質(zhì)。如中國藥典中的氧氟沙星所有品種，均在HPLC法的色譜條件下擬定了：取供試品溶液，置紫外燈下（254nm）照射4小時以上，使產(chǎn)生的緊鄰主峰前的雜質(zhì)峰與主峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定?！?不采用任何方式。,典型強