定量檢驗的分析性能驗證

1、定量檢驗的分析性能驗證,浙江省立同德醫(yī)院王 偉,引言,依據(jù)衛(wèi)生部《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》第三十條款CNAS-CL02：2008《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》（IOS15189:2007）第5.5條款實驗室應對方法學進行評價，以檢查其分析性能和對預期用途的適用性。,,CNAS-CL02：《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》（IOS15189:2012,IDT）第5.5條款檢驗程序的性能特征宜包括：測量正確度、測量準確度、測

2、量精密度(含測量重復性和測量中間精密度)、測量不確定度、分析特異性（含干擾物）、分析靈敏度、檢出限和定量限、測量區(qū)間、診斷特異性和診斷靈敏度,,,why,為什么要做性能驗證？,性能驗證是為了確保實驗室開展的檢驗項目，所應用的檢測系統(tǒng)的分析性能或檢驗項目的方法學(檢驗程序)能夠滿足檢測及臨床要求，從而保證患者標本檢測結果準確可靠。,進行性能驗證的場所,按照實驗室管理辦法和認可準則的要求，醫(yī)療機構臨床實驗室應承擔所開展檢驗項目的性能驗證工作

3、。,where,when,何時需要做性能驗證？,以下情況應完成初次性能驗證：新安裝的儀器擬開展的項目；新開展項目；同一項目的試劑變更廠家或檢驗方法發(fā)生變更時；儀器校準、發(fā)生故障維修后或更換主要的配件后，可能對結果產(chǎn)生較大的影響時，可選擇其所開展的部分檢驗項目進行分析性能驗證。,when,,初次驗證后，對精密度、正確度及可報告范圍等性能參數(shù)至少每12個月進行一次評估，可通過評估如CV、均值等室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)的變化趨勢（批間精密度）、室間質(zhì)評

4、項目的結果的可接受性（正確度）、臨床醫(yī)護人員對結果的反饋（可報告范圍）、小樣本的驗證等多種方式進行。若評估的結果不可接受，則需重新進行性能驗證。,哪些人員可以進行性能驗證試驗?,性能驗證試驗應由實驗室有資質(zhì)的檢驗人員完成，必要時可由技術支持人員協(xié)助完成試驗；而性能驗證報告必須由資深的檢驗人員完成，并經(jīng)科室主任審核后歸檔保存。,who,性能驗證包括哪些方面,定量項目性能驗證的內(nèi)容包括但不限于：精密度（批內(nèi)、批間）；正確度；檢測低限（靈敏度

5、）；攜帶污染率；線性范圍；可報告范圍；生物參考區(qū)間；檢驗結果量值溯源；測量不確定度；等。,what,如何實施性能驗證？,準備工作 范圍、材料、方案：應確定定量檢測的項目；所需的儀器、配套試劑、校準品、質(zhì)控品等材料；制定完整的性能驗證方案（尤其是各項性能參數(shù)的判斷標準的制定及其依據(jù)）。,how,,試驗要求：儀器應進行校準或保養(yǎng)；要盡可能在相同條件下進行各項試驗；所有試驗均需在室內(nèi)質(zhì)控結果在控的情況下方可進行。,性能驗證試驗,對于配套系

6、統(tǒng)，一般驗證以下內(nèi)容 準確度---EP-15 精密度---EP-5 可報告范圍---EP-6 參考區(qū)間---C28-A2對于非配套系統(tǒng)，內(nèi)容更多,一、精密度試驗,精密度試驗,在規(guī)定條件下，多次重復測定同一量時各測定值之間彼此相符合的程度 包括：重復性、再現(xiàn)性、中間精密度、實驗室內(nèi)精密度,精密度試驗,在規(guī)定條件下，多次重復測定同一量時各測定值之間彼此相符合的程度 包括： 重復性(repeatability)

7、 中間精密度(intermediateprecision) 重現(xiàn)性(reproducibility) 實驗室內(nèi)精密度（within-labprecision),,,,,中間精密度:簡單地說中間精密度是處于重復性條件與再現(xiàn)性條件之間的條件下得到的精密度。 實驗室內(nèi)精密度：同一實驗室內(nèi)，使用同樣的設備，由不同操作者在不同時間內(nèi)獲得的精密度，以前曾被稱為總精密度（不包括大的設備維護、儀器校準和更換試劑批號）,

8、,文件依據(jù) CLSI （原NCCLS）頒布的EP5-A2文件《定量測量方法的精密度性能評價-批準指南第二版》,,用于評估試驗的樣品 一般常采用臨床實驗室收集的穩(wěn)定和冷凍貯存的血清(漿)庫;當實驗室收集的樣品不穩(wěn)定或不易得到時，也可考慮使用穩(wěn)定的、以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的商品，如廠家的校準品和質(zhì)控品。一般采用日常工作中的室內(nèi)質(zhì)控品。,,樣品濃度 評估精密度時，建議評估高低二個濃度的精密度。當二個濃度的精密度有顯著差異時，建議增加

9、為三個 濃度。 所選濃度應為在測量范圍內(nèi)有醫(yī)學意義的值，即至少有一 個濃度在醫(yī)學決定水平(medical decision levels)左右。不要為了得到較小的精密度，都選用較高值的樣品，甚至超出 測量范圍。也不應選用靠近最低檢出限的樣品，此時所得 的精密度往往偏大。 如沒有醫(yī)學決定水平，可在參考區(qū)間上限左右選一個濃度 。此外再

10、根據(jù)檢驗項目的性質(zhì)在線性區(qū)間內(nèi)選擇一個值。,,試劑和校準品 評估批內(nèi)精密度時，要求在整個評估階段，盡可能使用相同條件，應使用同一種類同一批號的試劑和校準物,如有可能,只進行一次校準。使用不同批號試劑和多次校準都會增加檢驗結果的變異程度。,測量重復性（批內(nèi)精密度）,試驗方法：連續(xù)重復測定20/21次；結果計算：計算后20次檢測結果的SD和CV；判斷標準：以能力驗證/室間質(zhì)評評價界限作為允許總誤差（TEa），批內(nèi)精密度<1/4

11、TEa；或者符合試劑說明書的要求。注意事項：若選擇標本，則其濃度應盡可能接近質(zhì)控品或試劑說明書中評價該性能所提供的標本濃度,測量再現(xiàn)性（批間精密度）,試驗方法：每天1次測試，連續(xù)測試20天；或每天2次測試，連續(xù)測試10天；或每天4次測試，連續(xù)測定5天; 結果計算：剔除離群值后，計算20次檢測結果的SD和CV；判斷標準：<1/3TEa；或者符合試劑說明書的要求。注意事項：若選擇標本，首先應考慮檢測物的穩(wěn)定性，濃度要求同批內(nèi)

12、精密度；若檢測物不穩(wěn)定，則必須使用質(zhì)控品進行該試驗。,,總誤差（TEa）從CLIA’ 88允許誤差表中查閱評價的該項目的允許誤差范圍。 沒有CLIA 88允許誤差范圍的項目: EQA的允許誤差 試劑說明書提供,二、正確度與準確度,,?準確度(accuracy): 一次測量的結果與被測量真值的接近程度。 ?正確度(trueness): 真實度，大量測量的均值與真值的接近程度。,,,,文件依據(jù) CLSI 頒布的E

13、P15-A文件《用戶對精密度和準確度性能的核實指南》,,實驗方法 測定具有溯源性的標準物質(zhì)物質(zhì) 參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)評 樣本室間比對：要求與使用相同檢測方法的、質(zhì)量保證措施較好的、或已獲認可或的實驗室，或與使用配套分析系統(tǒng)的實驗室進行比對,,對3個不同水平的質(zhì)控品每個測定2次，測定均值與靶值的偏差小于衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)評的允許誤差表示準確度可以接受,三、可報告范圍驗證,,,? 線性范圍（Li

14、near Range)是指系統(tǒng)最終的輸出值（濃度或活性）與被分析物的濃度成正比的范圍。 ? 分析測量范圍（Analytical Measurement Range）方法直接測量標本，而不需要任何的稀釋、濃縮或者其它預處理等過程下，測量結果總誤差符合要求的分析物濃度的范圍。 ? 臨床可報告范圍（Clinically Reportable Range)是方法可采用對標本的稀釋、濃縮或者其他預處理用于擴展直接分析測量下的分析物值的范圍。,

15、,可報告范圍（Reportable Range）：實驗室可建立或驗證儀器或檢測系統(tǒng)測量相應的準確度實驗結果值的范圍。,,? 文件依據(jù) CLSI 頒布的EP6-A文件《定量測量方法的線性評價》,,? 儀器 應有較好的測定精密度及不存在明顯的攜帶污染等。對儀器應進行定期維護及校準，保證其處于 正常狀態(tài)。 ? 試劑 應注意試劑有效期及批號，不可采用過期試劑或 不同批號的試劑。 ? 校準品 可采

16、用與評價試劑配套的校準品。校準品的使用應嚴格按照產(chǎn)品說明，儀器校準步驟與間隔應按 照本室的標準操作程序進行。,,? 樣品類型 為避免基質(zhì)效應對結果的影響，選用的樣品應與臨床實驗樣品相似，但不可采用含有對測定方法具有明確干擾作用物質(zhì)的樣品，如溶血、脂血、黃疸或含有某些特定藥物的樣品。樣品物濃度應包括試劑廠商提供的試劑所能達到的線性范圍。,,? 樣品制備 收集臨床檢測過程中的高值樣品（H）和低值樣品(L)，若收集

17、不到低值樣品，可用生理鹽水或蒸餾水替代。將H和L樣品按：1L、3L+1H、2L+2H、 1L+3H、1H關系各自配制(必要時可改變比例)混合，形成系列評價樣品。,,? 樣品測定 在進行線性范圍確立時，應進行7-11個濃度水平的樣品測定，每個樣品重復測定2-4次。進行可報告范圍驗證時，應進行5個濃度水平的樣品測定，每個樣品重復測定2次。如果測定方法本身存在明顯的攜帶污染，應根據(jù)實際情況采取恰當措施盡量避免對測定結果的影響

18、。,,? 結果分析 1、以預期值為橫坐標，以實測值為縱坐標進行線性回歸，得到直線回歸方程Y＝aX+ b ， a在0.97～1.03范圍內(nèi)，r2＞0.95 ； 2、偏倚在允許誤差范圍之內(nèi)。,,可報告范圍的高限=可接受最大稀釋倍數(shù)×線性范圍（AMR）上限值；可報告范圍的低限：線性范圍的檢測低限或功能靈敏度為可報告范圍的低限。,四、參考區(qū)間的驗證,,,驗證已知參考區(qū)間在本實驗室應用的可接受性。,,?

19、 實驗方法 1、從健康人群中抽出20個參考個體（最好能夠覆蓋各個年齡段），依照實驗室標準操作規(guī)程檢測樣本。 2、發(fā)現(xiàn)離群值應棄用，并新的參考個體代替，以確保測試結果不含離群值。,,3、如果20例參考個體中不超過2例（10％的結果）的檢測值在參考區(qū)間外，則已知的參考區(qū)間可以接受。若3例以上超出界限，再選擇20個參考個體進行驗證，若少于或等于2個檢測值超過已知參考限，則已知參考區(qū)間可以接受。若又有3個以上超出參考限

20、，則就應該重新檢查所用的分析程序，考慮兩個樣本總體生物學特征上可能存在差異，并且考慮是否按照大規(guī)模研究指南建立自己的參考區(qū)間。,,關鍵在于——篩選“健康人群” 參考個體不應該是住院患者或者臨床病人，除非絕對需要。諸如可能是必需的小兒科或老年人的研究。,需要排除,經(jīng)常喝酒近期患病 獻血者哺乳期 血壓不正常肥胖 吸毒特殊職業(yè) 正在服用醫(yī)生開方的藥物濫用維生素,口服避孕劑 正在服用自購藥物懷孕 某些環(huán)境因素近期手

21、術 禁食或者非禁食吸煙 遺傳易感因素近期接受輸血 正在住院治療或最近住過院,,? 結果分析 按照實驗方法評估參考區(qū)間的可接受性。,五、攜帶污染的檢測,,,為了監(jiān)測生化分析儀的技術性能，評價其攜帶污染率是否能達到有關標準。攜帶污染率：指不同濃度樣品間連續(xù)測定的相互影響，主要是高濃度樣品對低濃度樣品的污染。,,實驗方法 選擇高值和低值兩份血清，按3次高值-3次低值順序測定，記錄測定結果，計算出均值和攜帶污染

22、率。,,計算公式 攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)*100% 其中H3代表第三次高值，L1代表第一次低值，L3代表第三次低值,,結論：平均攜帶污染率根據(jù)臨床實驗要求一般生化分析儀在2%范圍內(nèi)屬于可接受.,六、測量不確定度評定,,第一步 規(guī)定被測量,說明正在測量什么，包含：系統(tǒng)（需要對存在時間和空間的說明），如血清；組分及分析物，如鈣離子；量、質(zhì)量、濃度、活性等，如mmol/L,測量不確定度,CNAS-CL02：《

23、醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》（IOS15189:2012,IDT）第5.5.1.4條款實驗室應為檢驗過程中用于報告患者樣品被測量值的每個測量程序確定不確定度，實驗室應規(guī)定每個測量程序的測量不確定度性能要求，并定期評審測量不確定度的評估結果。實驗室在屆時結果量值時應考慮測量不確定度。需要時，實驗室應向用戶提供測量不確定度評定結果,測量不確定度評定方法,不確定度的評定方法有自上而下（Botton-up）和自上而下（Top-down）醫(yī)

24、學實驗室適用自上而下（基于正確度和精密度兩個主要分量）,不確定度評定過程,第一步 規(guī)定被測量第二步 識別不確定度來源第三步 量化不確定度第四步 計算合成不確定度,第二步 識別不確定度來源,①樣品（取樣程序、樣品代表性、存儲條件）②精密度（重復性、實驗室內(nèi)復現(xiàn)性）③校準（溯源性、值得不確定度、校準方法）④校準值正確性和測量不確定度、校準品與參考物質(zhì)的互通性⑤與樣本相關的效應（基質(zhì)、干擾物）⑥試劑、校準品和參考物質(zhì)

25、的批間差⑦不同的操作者⑧器材的變異（天平、移液器、容量瓶等）⑨環(huán)境的變化（溫度、濕度、震動、電壓等）,第三步 量化不確定度,1.實驗室內(nèi)測量復現(xiàn)性引入的測量不確定度評定（推薦的優(yōu)先次序）：①從實驗室室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)計算②從實驗室間比對（PT）數(shù)據(jù)計算③從重復測量常規(guī)樣本的合并標準偏差計算,第三步 量化不確定度,2.偏倚引入的測量不確定度的評定（推薦的優(yōu)先次序）①使用有證參考物質(zhì)（CRM），包括正確度質(zhì)控品②應用PT數(shù)據(jù)（

26、無計量溯源性PT項目應慎用）③與參考測量方法比較,第四步 計算合成不確定度,1.合成標準不確定度： 合成前，所有不確定度分量都必須以標準不確定度即標準偏差表示合成標準不確定度計算 UC=√u2c(bias)+u2(Rw)+…. uc(bias)為標準偏倚不確定度 u(Rw)為室內(nèi)復現(xiàn)性不確定度,,第四步 計算合成不確定度,2.合成相對不確定度： 合成前，所有不確定度分量都必須以相對標準

27、不確定度表示合成相對不確定度計算 Ucrel=√u2crel(bias)+u2rel(Rw)+…. uc(bias)為相對偏倚不確定度 u(Rw)為相對室內(nèi)復現(xiàn)性不確定度,,第四步 計算合成不確定度,3.擴展不確定度 擴展不確定度需要給出一個區(qū)間，合理地賦予被測量值的數(shù)量分布大部分會落在此區(qū)間內(nèi) 擴展不確定度計算 U=K *uc Urel=K*ucr

28、el U為擴展不確定度，Urel為相對擴展不確定度 K為擴展因子。正態(tài)分布K=2時，包含概率P=95.43%, K=3時,包含概率P=99.73% 通常采用K=2,測量不確定度的報告,1.血清葡萄糖 GLU=5.13mmol/L,U=0.18mmol/L(K=2) 表示95%的包含概率2. .血清葡萄糖 GLU=（5.13±0.18）mmol/L(K=2) 表示95%的包含概率,測

29、量不確定度的報告,報告的有效數(shù)字，在應用uc和U時大都采用兩位有效數(shù)字。在最終報告結果時一般做法是降測量不確定度修約到小數(shù)后一位（特殊要求例外）,小結,方法學的分析性能驗證包涵許多的內(nèi)容、技術要求較高，在實際工作中，應根據(jù)具體情況進行分析，在質(zhì)量體系允許的范圍內(nèi)，選擇合適的試驗方法完成此項工作，保留原始數(shù)據(jù)，結合制定的判斷標準，綜合分析試驗結果，以評價所選的檢驗程序能否滿足臨床實驗的要求，從而保障檢驗結果的準確性。,Thanks for