腦出血后的紅細(xì)胞溶解清除與谷氨酸毒性中RNF146作用的研究.pdf

1、背景:腦出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有很高的發(fā)病率與死亡率。它在每年新發(fā)的卒中病例中大約占有10％-15%的比例，這個比例隨著人口平均壽命的增加而增長。在過去幾十年里，ICH總的發(fā)病率與死亡率沒有顯著下降，其30天的死亡率約為30%-50%，并且只有20%的病人能在6個月后恢復(fù)自理能力。腦出血后大量的紅細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)中，這些紅細(xì)胞在早期就開始溶解并釋放出血紅蛋白。血紅蛋白在

2、損傷部位降解，最終的降解產(chǎn)物包括鐵、膽綠素、一氧化碳等，其中鐵能夠引起一系列下游分子反應(yīng)，如引起谷氨酸釋放，氧化應(yīng)激反應(yīng)等。這些應(yīng)激性反應(yīng)，引起腦出血后早期的腦水腫、血腦屏障破壞以及神經(jīng)元變性等大腦損傷。腦出血后引起的一系列繼發(fā)性分子病理事件是造成進(jìn)一步損傷的主要機(jī)制，尤其是谷氨酸損傷引起的鈣離子濃度升高以及氧化應(yīng)激反應(yīng)。RNF146是一種泛素化E3連接酶，研究認(rèn)為它在腦缺血后具有神經(jīng)保護(hù)作用。但是，RNF146在谷氨酸損傷中的具體保護(hù)

3、機(jī)制并不清楚。腦出血后若能及時清除血紅蛋白減少其代謝產(chǎn)物的生成，能夠極大減少神經(jīng)系統(tǒng)損害以及谷氨酸過量釋放等繼發(fā)性改變，同時使用RNF146治療可以減少其下游分子事件引起的繼發(fā)性損害。該研究結(jié)果提示：（1）腦出血后4小時就可以發(fā)生紅細(xì)胞溶解。（2）血紅蛋白代謝產(chǎn)物鐵可以引起血紅蛋白清除受體（CD163）與Haptoglobin的升高。（3）谷氨酸損傷可以引起神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生自噬。（4）RNF146可以通過調(diào)控谷氨酸誘導(dǎo)的自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

4、。本研究主要分為以下三個方面：
　　第一部分、腦出血后早期紅細(xì)胞溶解的作用與機(jī)制研究
　　背景：腦出血后血液從破裂血管中大量進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)中引起腦損傷。大量研究認(rèn)為血液中的紅細(xì)胞是導(dǎo)致腦損傷的重要因素。一般認(rèn)為紅細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)后在出血后一天左右開始溶解，溶解后釋放出大量的血紅蛋白引起腦腫脹與神經(jīng)元死亡等。因此，紅細(xì)胞的溶解程度與腦損傷程度密切相關(guān)。肝素是一種抗凝劑，能夠減少血液的凝固。但是如何測定腦出血后紅細(xì)胞溶解程度仍沒有方法

5、。肝素能否減慢紅細(xì)胞的溶解仍不可知。
　　方法：我們的實(shí)驗(yàn)分為三部分：首先，將SD大鼠分為兩組，一組注射100μl鹽水，另外一組注射100μl自體血。在4小時進(jìn)行核磁掃描T2,T2*，并測量腦腫脹比率與紅細(xì)胞溶解率。再次，將SD大鼠分為兩組，一組注射50μl濃縮紅細(xì)胞，另一組注射50μl溶解紅細(xì)胞。在4小時進(jìn)行核磁掃描T2,T2*以及R2* mapping，并測量腦腫脹比率與紅細(xì)胞溶解率。此外，切片進(jìn)行HE染色，F(xiàn)luoro-Ja

6、de C染色。免疫組化染色與Western-blot檢測Albumin蛋白水平。使用Matlab軟件分析R2* mapping圖像進(jìn)行鐵定量。最后，將SD大鼠分為兩組一組注射100μl自體血加載體，另一組注射100μl自體血加5個單位肝素。在4小時同樣進(jìn)行T2,T2*以及R2*mapping。并進(jìn)行HE染色，F(xiàn)luoro-Jade C染色。
　　結(jié)果：我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明腦出血后4小時已經(jīng)發(fā)生中線移位。從T2*影像結(jié)果得出，紅細(xì)胞溶

7、解在4小時已經(jīng)開始發(fā)生。此外，我們使用大鼠腦直接注射溶解紅細(xì)胞與濃縮紅細(xì)胞，觀察在T2，T2*及R2* mapping上影像學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶解紅細(xì)胞組在T2*上損傷區(qū)顯示為高信號區(qū)域，濃縮紅細(xì)胞在損傷區(qū)為低信號區(qū)域。溶解紅細(xì)胞組在4小時加重了腦腫脹程度。相比于濃縮紅細(xì)胞組，溶解紅細(xì)胞組引起的血腦屏障破壞更加嚴(yán)重。最后，我們研究肝素在腦出血后早期紅細(xì)胞溶解中的作用。結(jié)果表明肝素可以減少早期紅細(xì)胞溶解，并減少腦腫脹及神經(jīng)元變性。
　

8、　結(jié)論：腦出血后紅細(xì)胞的溶解會引起大腦腫脹，神經(jīng)元變性以及血腦屏障的破壞。肝素可以減少早期的紅細(xì)胞溶解，并且可以減輕腦腫脹及神經(jīng)元變性。
　　第二部分、腦出血后CD163與Haptoglobin（Hp）清除血紅蛋白的機(jī)制研究
　　背景：腦出血是一種在年長人群發(fā)生的致死性疾病，大量的紅細(xì)胞在腦出血后進(jìn)入腦組織細(xì)胞外間隙中。紅細(xì)胞的降解產(chǎn)物包括血紅蛋白，血紅素以及鐵，引起了驗(yàn)證的氧化與興奮性毒性作用并且最終導(dǎo)致大腦損傷。血紅蛋白

9、來源于血紅細(xì)胞溶解是腦出血后的主要損傷因素，血紅蛋白的毒性與氧自由基的形成與一氧化氮的清除具有密切關(guān)系。腦出血后的鐵超載可以造成大腦水腫以及大腦萎縮。前面的研究證明血紅蛋白在腦出血后表達(dá)在神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞中。然而，降解血紅蛋白的保護(hù)機(jī)制仍然不清除。
　　CD163屬于富含半胱氨酸的清除受體超家族，它在血紅蛋白的清除中發(fā)揮重要作用。同時CD163也是發(fā)揮抗炎作用小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物之一，它能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中血紅素氧化酶的激活。Hp是一

10、種含量頗豐的血漿糖蛋白，能夠與血紅蛋白結(jié)合。Hp在內(nèi)源性血紅蛋白清除系統(tǒng)中具有重要作用，主要依賴于其對游離血紅蛋白的解毒作用。Hp與血紅蛋白構(gòu)成的復(fù)合體與 CD163有很高的親和力。此外，研究發(fā)現(xiàn)Hp主要在大腦中主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞合成與分泌。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)主要分為四部分。第一部分，使用自體血注射腦出血模型檢測 CD163與Hp在第一天，第三天與第7天的表達(dá)變化。第二部分，使用FeCl2注射SD大鼠研究鐵超載在大腦中的作用。第三

11、部分，使用米諾環(huán)素研究其對鐵毒性與腦出血后CD163與Hp的作用。第四部分，我們使用原代小膠質(zhì)細(xì)胞研究CD163吞噬血紅蛋白的清除作用。
　　結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)CD163與Hp在腦出血第一天開始表達(dá)在皮層區(qū)神經(jīng)元與基底節(jié)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞并且在第7天達(dá)到表達(dá)高峰。CD163主要表達(dá)在皮層神經(jīng)元細(xì)胞與基底節(jié)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞上。Hp主要表達(dá)在基底節(jié)白質(zhì)束區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞上。鐵能夠激活CD163與Hp在皮層區(qū)與基底節(jié)區(qū)的表達(dá)。米諾環(huán)素能夠減少鐵與腦出血

12、引起的CD163與Hp表達(dá)。CD163抗體能夠阻止小膠質(zhì)吞噬血紅蛋白的能力。
　　結(jié)論：CD163與Hp在腦出血后一天表達(dá)升高并且在第7天達(dá)到表達(dá)高峰。鐵能夠增加CD163與Hp的表達(dá)，米諾環(huán)素治療可以減少鐵與腦出血后的CD163與Hp表達(dá)。CD163抗體可以拮抗小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬血紅蛋白的能力。
　　第三部分、RNF146對腦出血后谷氨酸興奮性毒性誘導(dǎo)自噬的作用與機(jī)制研究
　　背景：谷氨酸是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性興奮性

13、神經(jīng)遞質(zhì)。谷氨酸興奮性毒性是造成卒中，創(chuàng)傷性腦損傷，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等疾病后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要因素之一。自噬參與降解受損或損毀的細(xì)胞器，異常蛋白質(zhì)以及其他細(xì)胞質(zhì)組分的主要代謝過程，是谷氨酸興奮性毒性后的重要細(xì)胞代謝活動。RNF146是一種PAR依賴的E3連接酶，也是一種重要的調(diào)節(jié)分子，可以調(diào)控PARP1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。此外，RNF146還能夠酶正性調(diào)控Wnt信號通路，這是因?yàn)镽NF146參與了端錨聚合降解axin的過程。然而，目前還沒

14、有相關(guān)研究證明該通路在谷氨酸興奮性毒性中的作用。RNF146在谷氨酸興奮性毒性的作用及自噬及其下游分子通路仍然不清楚。
　　方法：我們的目的是檢測RNF146在谷氨酸興奮性損傷后如何調(diào)控自噬。首先，使用RNF146過表達(dá)慢病毒與干涉慢病毒轉(zhuǎn)染類神經(jīng)元細(xì)胞HT22細(xì)胞系，并對這些細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)與LDH細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。其次，我們觀察自噬在谷氨酸興奮性毒性損傷中的作用，使用了藥理學(xué)試劑調(diào)控自噬觀察HT22細(xì)胞的損傷程度。此外，我們還研

15、究了RNF146與Wnt信號通路的相關(guān)性，使用Wnt拮抗劑干擾Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。同時，為了研究Wnt信號通路在谷氨酸損傷后如何調(diào)控自噬，我們使用了Wnt信號的激動劑Foxy5，一種Wnt5a多肽類似物以及拮抗劑，JW74與IWP2。最后，我們還使用了Wnt/β-catenin信號通路抑制劑JW74去研究RNF146對自噬的負(fù)性調(diào)控作用。
　　結(jié)果：本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了上調(diào)RNF146能夠減少谷氨酸興奮性

16、毒性引起的細(xì)胞損傷。RNF146能夠抑制谷氨酸興奮性毒性或者雷帕霉素引起的過度自噬，保護(hù)神經(jīng)元不受到損傷。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在谷氨酸興奮性毒性中Wnt/β-catenin能夠負(fù)性調(diào)控自噬。過表達(dá)RNF146能夠通過抑制β-catenin降解復(fù)合體促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路。
　　結(jié)論：以上結(jié)果證明RNF146是一種神經(jīng)保護(hù)分子，能夠在谷氨酸興奮性毒性損傷保護(hù)神經(jīng)元不受到損傷。這種神經(jīng)保護(hù)作用很有可能是依賴于調(diào)控Wnt/β