雷帕霉素對卵清蛋白誘導(dǎo)引起的哮喘肺部炎癥的保護(hù)作用及其免疫機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘(asthma，簡稱哮喘)是一種由多種細(xì)胞和炎癥因子參與的慢性氣道炎癥疾病，表現(xiàn)為可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性(AirwayHyperresponsiveness，AHR)、氣道炎癥細(xì)胞浸潤、特定炎癥因子表達(dá)量增高和氣道重塑、氣道粘液分泌等。目前還存在許多難治性哮喘患者因?yàn)閷σ恍┏Ｒ?guī)治療哮喘的藥物不敏感，從而導(dǎo)致患者病情進(jìn)行性加重，最后發(fā)展成為重癥哮喘，給家庭社會都帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。因此，進(jìn)一步研究哮喘疾病發(fā)生發(fā)

2、展的分子機(jī)制，探索有效的治療藥物，對提高難治性哮喘患者的生存率、減輕肺功能的損傷意義深遠(yuǎn)。
　　 以往被普遍認(rèn)為哮喘的主要發(fā)病機(jī)制之一是Th2免疫反應(yīng)站優(yōu)勢的Th1/Th2免疫反應(yīng)失衡。流行病學(xué)調(diào)差顯示：近些年來，許多不典型哮喘病例的發(fā)病有增高趨勢。科學(xué)家們針對目前的現(xiàn)狀深入開展了許多科學(xué)研究，隨著一些新型Th細(xì)胞群(如Th17以及Treg細(xì)胞)的發(fā)現(xiàn)以及對其功能的研究，使得人們對哮喘發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識也更上一個(gè)臺階了，從過往的經(jīng)典

3、的Th1/Th2失衡機(jī)制逐漸轉(zhuǎn)換為多類Th細(xì)胞群(Th1、Th2、Th9、Th17以及Treg細(xì)胞)參與的免疫失調(diào)機(jī)制。
　　 雷帕霉素(Rapamycin或RAPA)是一種新型的大環(huán)內(nèi)脂類免疫抑制劑，起初雷帕霉素被研究作為低毒性的抗真菌藥物，1977年發(fā)現(xiàn)雷帕霉素具有免疫抑制作用，隨著對它的深入研究，我們了解到它通過不同的細(xì)胞因子受體阻斷信號傳導(dǎo)，阻斷T淋巴細(xì)胞及其他細(xì)胞由G1期至S期的進(jìn)程，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。1989年開

4、始把RAPA作為治療器官移植的排斥反應(yīng)的新藥進(jìn)行試用。近10年來，也有文獻(xiàn)報(bào)道RAPA能夠抑制哮喘小鼠氣道炎癥，但是對哮喘炎癥抑制效應(yīng)的分子機(jī)制還不明確。本研究主要通過建立哮喘小鼠模型，觀察雷帕霉素對哮喘小鼠氣道炎癥的影響及其可能免疫機(jī)制，一期望為臨床治療難治性哮喘的新藥開發(fā)提供新的干預(yù)方向。
　　 目的：構(gòu)建卵清蛋白誘導(dǎo)引起的急性哮喘的動(dòng)物模型，探索雷帕霉素在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用及其相關(guān)免疫機(jī)制。
　　 方法：6-

5、8周齡的C57BL/6雌性小鼠按體重大小編號，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字，按照隨機(jī)數(shù)字大小分組，將實(shí)驗(yàn)小鼠平均分為SHAM組、SHAM+RAPA組、OVA組和OVA+RAPA組。SHAM組給予PBS致敏霧化，RAPA組為小鼠PBS或者OVA霧化前1小鼠腹腔注射雷帕霉素(1mg/kg)。觀察各組小鼠肺泡支氣管灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、分類細(xì)胞計(jì)數(shù)、病理學(xué)檢測；采用熒光定量PCR測肺、脾臟組織中炎癥因子以及炎癥因子受體的表達(dá)；采用ELISA的方法檢

6、測肺組織勻漿中炎癥因子的表達(dá)；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中CD4+T細(xì)胞和CD4+IL-17A+T細(xì)胞比例和數(shù)量的改變；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺、胸腺和淋巴結(jié)中CD4+Foxp3+T細(xì)胞的比例和數(shù)量的改變。
　　 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)利用卵清蛋白致敏霧化構(gòu)建急性哮喘模型。通過對SHAM組和OVA組的BALF細(xì)胞數(shù)、肺組織病理學(xué)以及炎癥因子表達(dá)等多項(xiàng)指標(biāo)的檢測，符合急性哮喘模型的特征，提示造模成功。通過霧化前1h腹腔注射RAPA實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)性給藥，

7、與OVA組相比，RAPA干預(yù)哮喘小鼠之后，BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞比例和絕對數(shù)量均有明顯下降(P<0.001)，抗原暴露引起的中性粒細(xì)胞數(shù)量增高的現(xiàn)象也在RAPA干預(yù)之后明顯減少，又統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；肺組織病理學(xué)HE染色結(jié)果提示：RAPA干預(yù)哮喘小鼠之后明顯減少支氣管血管之間的炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮增生肥厚現(xiàn)象也明顯改善(P<0.01)，值得注意的是RAPA干預(yù)基礎(chǔ)狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)小鼠，能刺激之氣管上皮增生肥

8、厚(P<0.05)；肺組織病理學(xué)PAS染色結(jié)果提示：RAPA干預(yù)之后，抗原誘導(dǎo)的肺組織內(nèi)粘液分泌增多受到抑制，表現(xiàn)為PAS陽性顆粒數(shù)明顯減少(P<0.001)，Q-PCR檢測粘蛋白Muc5AC的基因表達(dá)水平也被RAPA干預(yù)抑制(P<0.05)；炎癥因子(如IL-13、IL-17A、IL-25)以及炎癥因子受體(IL-17RB)的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；肺組織勻漿中炎癥因子(IL-17A和IL-6)下調(diào)(P<0.05)；流式細(xì)胞