山新楊遺傳轉(zhuǎn)化條件篩選與轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因研究.pdf

1、山新楊(Populus davidiana Dode×P.bollena Lauche)以黑龍江野生山楊為母本，新疆楊為父本的人工雜交種。雖然山新楊和其楊樹他品種相比具有一定的抗病性，但也常常遭受病原菌的侵染而引起大面積流行，給林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)建設(shè)造成巨大的損失。針對(duì)楊樹病害種類多、流行快、危害重的實(shí)際，本文以山新楊為受體材料、以幾丁質(zhì)酶為目的基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進(jìn)行了抗真菌病害轉(zhuǎn)山新楊的研究。
　　1、以1/2MS附加0.

2、03 mg/La-萘乙酸(NAA)和0.05 mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)為葉片分化培養(yǎng)基、1/2MS附加0.05 mg/La-萘乙酸(NAA)和0.05 mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)為莖段分化培養(yǎng)基和1/2MS附加0.25 mg/La-萘乙酸(NAA)為生根培養(yǎng)基對(duì)山新楊進(jìn)行組培和擴(kuò)繁，為遺傳轉(zhuǎn)化提供優(yōu)良的受體材料。
　　2、通過抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)，分別確定了山新楊葉片轉(zhuǎn)化中卡那霉素最佳臨界濃度為8 mg/L、生根篩

3、選培養(yǎng)的最佳臨界濃度為40 mg/L、頭孢噻肟鈉除菌最佳濃度為800 mg/L。
　　3、以山新楊葉片為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，菌液的侵染最適濃度為OD600≤0.1、最佳侵染時(shí)間為5min。在該組合條件下，共培養(yǎng)基中不添加CoCl2·6H2O比添加CoCl2·6H2O的分化率提高1倍以上，轉(zhuǎn)化率提高近1倍。
　　4、根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山新楊遺傳轉(zhuǎn)化率的菌液濃度、侵染時(shí)間、乙酰丁香酮和共培養(yǎng)時(shí)間四種因素的最

4、佳組合。建立了以1/2MS液體培養(yǎng)基附加50μmol/L乙酰丁香酮于28℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)12～14h;菌液離心收集菌體后用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮稀釋至OD600=0.1，侵染2～5min;共培養(yǎng)培養(yǎng)基中去除CoCl2·6H2O并附加200μmol/L乙酰丁香酮，共培養(yǎng)3d為最佳轉(zhuǎn)化體系。
　　5、以生長(zhǎng)10～15d的山新楊組培苗葉片為受體材料，利用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)組合對(duì)324個(gè)葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化，共得18株卡那抗性芽，經(jīng)PC