藥物分析第十六章藥品質(zhì)量控制中的現(xiàn)代分析方法與技術

1、現(xiàn)代分析方法與技術為藥學的發(fā)展提供了適時而有效的輔佐與動力。,如：色譜及其聯(lián)用技術實現(xiàn)了藥學的現(xiàn)代分子水平的研究。手性毛細管電泳及色譜分離與測定技術為手性藥物研究與質(zhì)量控制提供了保障?，F(xiàn)代光譜技術使藥物結構分析鑒定也變得尋常容易，藥物的微量雜質(zhì)檢定與控制系統(tǒng)全面。,Capillary electrophoresis,CE,第一節(jié)、藥物現(xiàn)代色譜法及其應用Modern chromatography & its appl

2、ication in pharmaceutical analysis,⊙Near infrared spectrometry,NIRS,⊙Nuclear magnetic resonance spectrometry,NMRS⊙X-ray diffraction method,第二節(jié)、現(xiàn)代光譜法及其應用Modern spectrometry & its application in pharmac

3、eutical analysis,HTC(Hyphenated Techniques in Chromatography),MS(Mass Spectrometry),GC-MS,HPLC-MS,HPLC-NMR,FTIR(Fourier Transform Infrared),⊙毛細管電泳分析法,毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）是80年代初發(fā)展起來的一種高效、快速的分離分析技術。在藥物分析中有著

4、重要的應用與發(fā)展前景自20世紀90年代初Menz等提出“微型全化學分析系統(tǒng)”（miniaturized total chemical analysis system，?-TAS）概念以來，分析技術的微型化、集成化和自動化一直是分析科學發(fā)展的主導趨勢，其中芯片毛細管電泳技術的研究已取得突出進展，在生物、臨床、醫(yī)藥、工業(yè)和環(huán)境等領域中得到廣泛應用。與傳統(tǒng)毛細管電泳技術相比，芯片毛細管電泳具有樣品用量更少，分離速度更快的特點，但對檢測的靈敏

5、度和響應速度提出了更高要求,1.高效 2.高速 3.微量 4.低消耗,HPCE是經(jīng)典電泳技術和現(xiàn)代微柱分離相結合的產(chǎn)物。與HPLC相比，均為液相分離技術，都有多種分離模式，且儀器操作可自動化；但遵循不同的分離機理。在很大程度上，HPCE和HPLC互為補充。HPCE更具有如下優(yōu)點：,但HPCE的檢出靈敏度和精密度不及 HPLC,,,,,毛細管電泳裝置示意圖,1.高壓電源 2.光電倍增管 3.液冷溫控毛細

6、管 4.光源 5.數(shù)據(jù)采集 6.緩沖液/樣品 7.緩沖液,,,,,,,,,,,,,,,30kV,7,1,2,3,4,5,6,a. 毛細管中電滲流呈“塞式流”流型,b. HPLC柱中壓力驅(qū)動呈拋物線流型,Electroosmotic Flow, EOF,Electrophoresic Flow,EPF,,,,,毛細管電泳裝置示意圖,1.高壓電源 2.光電倍增管 3.液冷溫控毛細管 4.光源 5.數(shù)據(jù)采集 6.緩沖液/樣品 7.緩沖液,,

7、,,,,,,,,,,,,,30kV,7,1,2,3,4,5,6,應用示例,電泳條件　石英毛細管（未涂層）57cm×50µm，優(yōu)化選擇25mmol/L磷酸二氫鈉-12.5mmol/L硼砂-25mmol/L SDS（pH7.8）為電泳介質(zhì)，操作電壓20kV，柱溫23℃，測定波長205nm 本文建立的優(yōu)選方法可在11min內(nèi)測定利巴韋林及中間體含量，與HPLC測定需1h相比，更快速。本方法也可用于利巴韋林制劑中中間體的控

8、制,＊利巴韋林及各中間體的定量分析,＊復方甘草片中甘草酸、甘草次酸、嗎啡和 苯甲酸鈉的分析[21],復方甘草片為常用鎮(zhèn)咳祛痰藥，臨床上有廣泛的應用。每片含甘草浸膏（中粉）112.5mg、阿片粉4.0mg、樟腦2.0mg、八角茴香油2.0mg、苯甲酸鈉（中粉）2.0mg 電泳條件　石英毛細管65cm×75µm i.d.，有效長度50cm，運行緩沖液為50mmol/L硼砂溶液；運行電壓14.0kV，電流70

9、81;A；測定波長228nm；重力進樣10s（高度7cm）定量分析　經(jīng)分析方法驗證，本法具有良好的線性關系，回收率大于97.0%。該法可作為快速、準確測定復方甘草片中多組分含量的有效方法,藥物現(xiàn)代光譜法及其應用,⊙近紅外分光光度法,優(yōu)點：無邊緣干擾，線性范圍(A~C)寬水份吸收不覆蓋C-H、N-H、O-H吸收帶適用于水溶液樣品，含水固體和泥漿狀樣不經(jīng)溶劑稀釋，不必制備KBr片，可直接測定，定量效果優(yōu)于GC、HPLC和FTIR,峰

10、強度 < 1/100~1/10基頻峰強度,方法特點,可獲得一系列物理性質(zhì)的信息　由NIRS可得到如密度、粒子尺寸、纖維直徑、大分子聚合度等特殊信息 樣品無需預處理　NIRS法僅需將樣品裝入樣品池內(nèi)而不必作預處理。一般，液體樣品可以直接裝入光路長1～30mm的石英池中。固體樣品可直接放入具有石英窗的反射樣品杯中；蓋上彈簧壓縮蓋，即可。在1 min內(nèi)即可完成裝樣；取出樣品、清洗杯子的時間也不需1min,NIR反射譜又與MIR不同，它

11、有以下特點：,分析速度快　通常，將樣品杯置入NIR 光譜儀內(nèi)，每秒進行5次掃描；一般掃 描50次求得平均值制得最后的光譜，繼 之將光譜數(shù)據(jù)進行加工以作數(shù)據(jù)的定量 或定性的解釋。通常，作一次NIRS分 析僅需2 ~3 min,靈敏度高　NIRS光源強度較大，檢測器的反應靈敏度較高，因而檢測信噪比高，尤其在散射效應強時，散射-吸收比高,運用范圍廣　在反射和散射NIR中，高　的信噪比可以得到良好的線性關系，　

12、對分析樣品的外觀寬容度大，既可以　用于清澈的氣、液、固樣品的測定，　又可用于粉末狀、糊狀、絲狀和不規(guī)　則狀樣品的分析,便于在線分析和控制　NIR區(qū)內(nèi)還有價格便宜耐用的透明材料（一般的光學玻璃）作為分析窗口，便于實現(xiàn)快速、實時，并有池長對分析結果影響小，定量分析的范圍寬等優(yōu)點,應用示例 諾氟沙星膠囊的NIRS分析,UV、HPLC測定含量，均需對樣品進行預處理，較繁瑣費時。采用近紅外漫反射光譜（near-infared diffus

13、e reflectance spectrometry，NIRDRS）技術及偏最小二乘法（PLS）對諾氟沙星膠囊進行含量測定的回收率好，與其他方法相比，還具有分析簡便、快速的優(yōu)點,⊙核磁共振光譜分析法,核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance spectrometry，NMRS)技術已在BP和USP中應用，在新藥的研制中，如藥物結構確證，藥物代謝物的研究和藥物的篩選和設計等方面，更是重要的分析方法之一。重點討論定

14、量分析方法及應用示例,簡述,NMR (nuclear magnetic resonance),肌肉松弛劑,定性、定量和雜質(zhì)檢查,不同藥物具有不同NMR圖譜,樣品中每個組分有一個或一組特征的、且互不重疊的吸收峰,Maolate 異構體Ⅰ,Maolate 異構體Ⅱ,內(nèi)標法（絕對測量法）,NMR最常用的定量分析方法內(nèi)標物的要求：最好能產(chǎn)生單一的共振峰，與樣品間隔≥30Hz能溶于分析溶劑中有盡可能小的質(zhì)子當量不應與樣品中任何組分相互作

15、用,亞硝酸戊酯(Amyl nitrite)及其吸入劑(Amyl nitrite inhalant)的NMR定量分析 USP,分子中與亞硝基相鄰的次甲基上的質(zhì)子呈現(xiàn)多重峰 δ?4.8ppm內(nèi)標 ：苯甲酸芐酯 C6H5COOCH2C6H5 呈現(xiàn)單一峰 δ=5.3ppm以TMS為對照

16、 δ=0. ppm,3-甲基-1-丁醇亞硝酸酯,2-甲基-1-丁醇亞硝酸酯,應用示例,＊鹽酸普魯卡因的結構鑒定＊植物中藥及其偽品的區(qū)別,偽品中藥在外觀特征上幾可以假亂真，但其化學成分的組成，尤其是活性成分卻不可能與正品完全一致，并且相差甚遠。以正品植物中藥的1H-NMR相對標準圖譜為參照，只需比較所鑒別樣品的1H-NMR譜就可以斷定中藥的真?zhèn)巍Ｒ匀藚槔f明之,試驗測定了偽品人參，其1H-NMR指紋圖均與正品的特征峰毫無相似之處,＊亞

17、硝酸戊酯（amyl nitrite）及其吸入劑（amyl nitrite inhalant）的含量測定（USP 24）,⊙ X射線粉末衍射法,X射線是倫琴在1895年發(fā)現(xiàn)的，又曾稱為倫琴射線。本質(zhì)上是波長很短的電磁波，一般認為波長為0.01～1nm，較紫外線還短。作為波，就可以產(chǎn)生衍射。所謂衍射，就是繞過障礙物邊緣向前傳播的現(xiàn)象當X射線射到晶格排列整齊的晶體上，僅僅在某些方向有光線反射，這就是 X射線的衍射。有光線反射的方向可用

18、布拉格方程加以描述,X射線衍射法的理論依據(jù),式中θ為掠射角；dhkl為 晶面間距；hkl為晶面指數(shù)，即晶面與晶軸截距的倒數(shù)之比，也叫密勒指數(shù),布拉格方程,,布拉格方程給出了什么條件下衍射的X射線可能從晶體射出［已知晶面間距(d)和入射線波長(λ) ，即可求出衍射線方向(θ)］，也可給出進行X射線衍射的晶體的晶面間距［已知入射線波長(λ)和衍射線方向(θ) ，即可求出晶面間距(d)］

19、。當然晶面有若干組，都可產(chǎn)生相應衍射，這些衍射均可由X射線衍射儀進行測定,X射線衍射儀的工作原理,⊕X射線管中不同靶材料， 如銅、石墨等可發(fā)出各自 特征波長 ⊕ 晶體粉末盡可能緊密地裝入玻璃毛細管，壓成多晶圓柱體。當穿過鉛塊狹縫的一細束X射線射到晶體粉末時，總會有取向合適的微小晶體，使射線在其表面反射最強,X射線衍射儀的

20、工作原理一般采用粉末法。粉末衍射儀的構成與工作原理見下圖,由反射方向，根據(jù)布拉格方程即可求出晶　面間距，進而求出鍵長。本法可同時將各　種波長的X射線反射到不同方向，記錄為　衍射圖譜,在新藥研制過程中，必需對藥物結構進行確證，固體樣品一般要做X射線粉末衍射分析，以便從測定結果可比較研制品與對照品是否一致。X射線粉末衍射法是藥物晶型進行定性鑒別的重要方法之一,應用,＊應用示例　西咪替丁的晶型研究 尹華等 藥物分析雜志 2

21、001，21(1)：39~42,測試條件：Cu kα（靶），50kV-80mA（工作電壓-電流），8(º)/min，DS=SS=1℃，RS=0.15mm(狹縫)，2θ A晶型和B晶型的X射線測定數(shù)據(jù)見表 X射線衍射法除了用于晶型鑒別外，也可用于晶型藥物的定量分析,A晶型和B晶型的X射線測定數(shù)據(jù),A晶型　　　　　　　　　　　　B晶型,衍射角　　晶面距　　豐度比　　衍射角　　晶面距　 豐度比,＊X射線晶體結構分析

22、,若以已知波長的X射線入射，也會對不同的平面族獲得最強的反射，據(jù)此可以測定晶格常量，進而確定晶格構造。這就是 X射線晶體結構分析重要意義確定藥物結構及生物大分子結構原理如此，具體做起來還是一件十分復雜的工作，特別是對新化合物結構的確定，常要借助于電子計算機，例如四圓衍射儀，可以直接測量化合物的鍵長鍵角等數(shù)據(jù),色譜聯(lián)用技術及其應用,GC-FTIR系統(tǒng)組成,著重圍繞幾種應用較廣泛的色譜聯(lián)用技術及其在藥物分析中的應用予以簡述,⊙氣相色

23、譜-紅外光譜聯(lián)用技術,GC/FI-IR聯(lián)用光路示意圖,拋物面鏡,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,干涉儀,,光源,接口,橢面鏡,光管,FID或放空,GC柱出口,GC,FT-IR,IR,拋物面鏡,,麝香風濕油GC分析圖譜 1.α-蒎烯 2.β-蒎烯 3.桉樹腦 4.樟腦 5.水楊酸甲酯 6.桂皮醛 7.茴香酸甲酯 8.丁香酚 9.2-甲基十一烯 10.鄰苯二甲酸二丁酯 11.正十六烷,11,t(min),1,2,3,

24、4,5,6,7,8,9,10,⊙氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術,,GC-MS儀的接口組件是解決氣相色譜和質(zhì) 譜聯(lián)用的關鍵組件，它起傳輸試樣，匹配兩者工作流量（也就是工作氣壓）的作用。理想的接口應能去除全部載氣而使試樣毫無損失地從氣相色譜儀傳輸給質(zhì)譜儀。要求試樣傳輸產(chǎn)率高，濃縮系數(shù)大，延時短，色譜的峰展寬少,GC-MS工作原理示意圖,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,載氣,樣品,進樣器,色譜柱,分子分離器,,抽真空,記錄儀,放大器,離子源,

25、分析器,電子倍增管,,,放大器,示波器,,,質(zhì)譜,,,,,,,,,,,,,,應用示例,在藥物中毒急救、預防和刑事偵破工作中常需要在生物體液中進行未知毒物的鑒定。由于未知毒物的范圍非常廣泛，理化性質(zhì)各異，因此，有必要建立一系統(tǒng)化的盡可能多的毒物藥物的分析方法,＊固相萃取結合GC-MS系統(tǒng)分離生物體液中常見毒物藥物,＊GC-MS測定冰片和川芎嗪血藥濃度,,GC-MSD的選擇性離子檢測色譜圖A.標準樣品 B.血漿樣品1.川芎嗪

26、2.樟腦 3.4.龍腦,質(zhì)譜圖,⊙液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術,粒子束（partical beam）接口 不適用于極性的、熱不穩(wěn)定的和分子量大于1000的樣品分子 熱噴霧（TSP）接口　TSP接口的應用正逐步減少,以下重點闡述LC-MS的關鍵部件、接口裝置和應用,接口裝置,USP（24）中列出了如下幾種接口裝置,大氣壓離子化（API）接口 是目前商品 化LC-MS儀采用最廣的接口,動態(tài)快原子轟擊法（FAB）　FAB法適合于高活性

27、、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性低及分子量大的樣品分析，而且樣品用量少。該接口的缺點是限制HPLC的流速，通常為10?l/min，只能使用微型柱,應用示例,曲安奈德中特殊雜質(zhì)的檢查,曲安縮松(TACA) Triamcinolone Acetonide,雜質(zhì)峰,,,,,,3.85′,,,,,,,,,,,,,,,,350,600,550,500,450,曲安縮松及其雜質(zhì)的質(zhì)譜TACA:曲安縮松；desmethylene TACA:去甲曲安縮松,400

28、,50,100,150,200,250,300,,,,,,,100.0,100.0,50.0,50.0,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,293,59,75,85,93,115,135,147,159,173,187,199,213,225,237,269,253,281,590,569,549

29、,535,519,507,493,475,463,455,443,435,421+,339,347,359,415,387,377,367,293888,293888,TACAMH+,-HF,TACA,(M+C2H5)+,(M+C2H5)+,Desmethylene,TACA MH+,421+,去甲曲安縮松 Desmethylene TACA,,曲安縮松(TACA) Triamcinolone Acetonide,⊙液相色譜-核磁共振聯(lián)

30、用技術,LC-MS已成為復雜體系中各化合物結構分析的重要方法，而MS無法完全解決位置異構、立體異構等化學結構問題,氯芐律定抗心律失常藥86017代謝的初步研究,中文名 7-(4-氯芐基)-7,8,13,13a- 四氫小檗堿氯化物英文名 7-(4-Chlorbenzyl)-7,8,13,13a-tetrahydroberberine chloride; CTHB,86017 保

31、持了母體化合物的生物活性：母體具有正性肌力，降低動脈血壓，增加冠脈流量及抗心律失常作用，但口服不吸收，生物利用度差,對心律失常及心室纖顫有較強的防治作用，對急性心肌梗塞亦有較好療效，而且口服能吸收,Berberine(B) Tetrahydroberberine(THB),C18柱 250?4.6mm, 10µm色譜條件：甲醇:水:三乙胺:冰HAc(60:40:0.04:0.03)