狂犬病毒基礎知識及生產(chǎn)工藝

1、狂犬病毒基礎知識及疫苗生產(chǎn)工藝,2016年04月,目錄,狂犬病病毒歸屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae），病毒形態(tài)是一端平坦或略凹狀，另 一端為半原形，酷似子彈，故得名彈狀病毒，病毒大小75*175nm經(jīng)組織培養(yǎng)后，病毒的形態(tài)多呈兩端平坦狀的顆粒。單鏈RNA病毒.,狂犬病毒的特點,,狂犬病毒形狀,狂犬病病毒電鏡照片,狂犬病毒對外界的抵抗力很弱，對溫度敏感，60 ℃30~60min，100℃ 2min即可滅活。病毒對陽光、紫外線敏

2、感，各 種常見的消毒劑如肥皂水、碘酒、3%來蘇爾、75%酒精等均可使其滅活。 抗生素對其卻無滅活作用。,狂犬病毒的特點,狂犬病病毒最大的特點是對神經(jīng)組織的嗜性遠遠大于其他組織。在神經(jīng)組織內(nèi)病毒復制的比率遠比在其他組織內(nèi)高。,狂犬病毒的特點,1、狂犬病毒形狀為子彈形，一端為橢圓形，另一端平整。2、狂犬病毒具有嗜神經(jīng)性，主要在中樞神經(jīng)內(nèi)繁殖。3、狂犬病毒最初進入傷口時，不進入血液循環(huán)，而是在被咬傷的肌肉組織中復制，然后侵入神經(jīng)系統(tǒng)。

3、4、狂犬病毒在神經(jīng)軸中的移動速度約5~100mm/天，如一定范圍內(nèi)（10um-2cm）的軸突同時受感染，病毒移行速度甚至會更快。,狂犬病毒的特點,野生動物與家畜是狂犬病的傳染源。人類狂犬病由狗、貓直接傳染者占90%以上，其次為牛（主要是水牛）、豬、兔、馬、驢騾以及野生動物。,狂犬病毒的宿主動物,狂犬病致病機理,一般 20 – 60 天從暴露后數(shù)天到數(shù)年，差別非常大主要的影響因素,感染的病毒數(shù)量 感染的病毒株 暴露的嚴重程度

4、 暴露的部位,一般20 - 60天 1月內(nèi)發(fā)病71% 3月內(nèi)發(fā)病87%,潛伏期,人用狂犬病疫苗發(fā)展史,1882年，巴斯德成功在牛腦中分離到狂犬病毒株，并在兔腦內(nèi)連續(xù)傳90代，成為固定毒。1885年，巴斯德嘗試研制減毒活疫苗1911年，Semple在巴斯德的研究基礎上，研制出腦組織滅活疫苗；1956年，Peck研究制備鴨胚疫苗（DEV）。該疫苗在美國和其他國家用作狂犬病暴露后處理并廣泛使用了27年，很少觀察到嚴重的副作用，但中

5、和性抗體水平不如腦組織疫苗。1964年，美國研制出人二倍體細胞疫苗，并于1978年開始商品化，目前在美國、加拿大、大多數(shù)歐洲國家和幾個亞洲國家使用。1984年由法國Merieun研究所研制成功Vero細胞疫苗,國外疫苗發(fā)展史,國內(nèi)疫苗發(fā)展史,1949年，羊腦組織疫苗1980年，原代地鼠腎細胞疫苗（淡苗）之后經(jīng)歷了濃縮苗、精致苗、無佐劑純化苗90年代，引進Vero細胞疫苗2005年6月30日，無佐劑疫苗,人用狂犬疫苗生產(chǎn)工藝,

6、,原始種子（3aG4）→豚鼠腦內(nèi)傳代（3aG 5）→地鼠腎細胞傳代（4aG ）→豚鼠腦內(nèi)傳2代（ 4aG2）→建立主代毒種庫主代毒種庫（ 4aG2）→豚鼠腦內(nèi)傳1代（ 4aG3） →建立主工作毒種庫,毒種制備工藝：,毒種制備工藝：,地鼠→消毒、解剖、取腎、消化→細胞制備→接種病毒→洗換→收獲病毒液→滅活病毒→超濾濃縮→純化→半成品配制→洗瓶、灌裝、軋蓋→目檢→包裝→入庫,地鼠的挑揀清洗：純化水4~6遍，注射用水3遍消毒：2%甲醛溶

7、液2遍，0.1%新潔爾滅2遍解剖：扒皮、剪肌、取腎洗腎：消化：0.1%胰蛋白酶每對腎加入3~4ml，置2~8℃消化15~18小時。,解剖消化工藝,地鼠消毒,解剖地鼠,培養(yǎng)液配制：Hanks’ 液＋營養(yǎng)液＋小牛血清＋硫酸慶大霉素細胞制備：棄去消化液，洗滌腎塊，搖振分散細胞，反復收集數(shù)次。細胞培養(yǎng)：37±1℃培養(yǎng)90-100小時,細胞制備工藝,細胞培養(yǎng),地鼠腎細胞,細胞觀察毒種配制接種培養(yǎng)吸附： 34±1

8、℃ 培養(yǎng)吸附18-24小時,接種病毒工藝,維持液配制：199＋0.2~0.4%人血白蛋白＋碳酸氫鈉洗滌細胞換維持液病毒培養(yǎng)： 34±1℃ 培養(yǎng)96～120小時,洗換工藝,細胞觀察收獲病毒液：收獲標準加液：加維持液取樣檢定保存：收獲液置2~8℃保存、待檢；細胞瓶置34±1℃ 繼續(xù)培養(yǎng)96～120小時,多次收獲病毒液、加液工藝,收獲液檢查無菌轉入加滅活劑：終濃度甲醛溶液250µg/ml 滅活

9、過程：滅活罐內(nèi)混勻，于34℃±1℃恒溫滅活18～20小時 取樣檢定,病毒滅活工藝,采用截留分子量為300KD的濾膜超濾濃縮至蛋白質(zhì)含量在2000～3000µg/ml范圍內(nèi)（濃縮倍數(shù)為50±10倍）按照病毒收獲液體積的0.3～0.6倍的滅菌PBS對濃縮液進行分段洗濾,超濾濃縮工藝,濃縮液離心層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠Sepharose 4FF 純化：以pH 7.5的PBS洗脫，洗脫液流速240～280ml/

10、分鐘，280nm紫外檢測,收集第一峰。取樣檢定,純化工藝,配方計算：抗原含量≥4.5IU/ml，蛋白質(zhì)含量應不高于80µg/ml 配制：將純化后原液及終濃度為1%的人血白蛋白、40µg /ml的硫柳汞 轉入合并罐內(nèi)混勻。取樣,配制工藝,西林瓶清洗、滅菌：經(jīng)超聲波清洗后350℃ 5分鐘干熱滅菌 分裝：疫苗每支裝量不少于標示量 軋蓋：通過傳輸帶傳至軋蓋間，自動上機進行加蓋封口 。,灌裝工藝,外觀檢查：雙眼平視西

11、林瓶，首先檢查裝量是否準確；再移至目檢臺黑、白色底板處檢查是否有異物。,目檢工藝,包裝規(guī)格:小盒：5瓶/人份中盒：10人份/盒大箱：120人份/箱,包裝工藝1,包材噴印 按包裝指令上內(nèi)容對小盒、中盒、大箱、合格證進行調(diào)試印制，“產(chǎn)品批號”、“生產(chǎn)日期”及“有效期至”印制位置適中，字體應清晰。包裝前核對 對所有包材印制“產(chǎn)品批號”、“生產(chǎn)日期”及“有效期至”內(nèi)容的核對應與包裝指令內(nèi)容一致無誤。,包裝工藝2,裝盒：將計數(shù)

12、后西林瓶逐一進行標簽印制貼附；取5只貼簽后西林瓶裝入白色盒托，上放一份說明書裝入小盒，貼上封口簽；取10小盒裝入一中盒，貼上封口簽；取12中盒裝入一大箱。最后放一張產(chǎn)品合格證進行封箱捆扎轉入2～8℃冷庫整齊擺放。,包裝工藝3,電子監(jiān)管碼生成及貼附 對10小盒產(chǎn)品進行一級電子條碼掃描生成一個二級條碼貼附在對應的中盒包裝指定位置；對12中盒產(chǎn)品進行二級電子條碼掃描生成兩個三級條碼貼附在對應的大箱包裝指定位置。,包裝工藝4,1、外觀：

13、依法進行檢查，結果為無色澄明液體，無異物。2、裝量：依法進行裝量檢查，應不低于標示量1.0ml/劑。3、化學檢定（1）pH值：依法進行檢測，pH值應為7.2～8.0。（2）硫柳汞含量：依法進行硫柳汞含量檢測，結果應為30～50µg/ml。（3）游離甲醛含量：依法進行游離甲醛含量檢測，結果不得高于40µg/ml。,成品檢定,4、效價測定：依法檢查，放行標準應不低于4.0IU/劑。有效期內(nèi)標準應不低于2.5IU

14、/劑。 5、熱穩(wěn)定性試驗：疫苗出廠前應進行熱穩(wěn)定性試驗。于37℃放置14天后依法進行效價測定，應不低于2.5IU/劑。 6、牛血清白蛋白殘留量測定：依法進行牛血清白蛋白殘留量測定，結果應不高于50ng/劑。,成品檢定,成品檢定,7、抗生素殘留量測定：依法進行硫酸慶大霉素殘留量測定，結果應不高于50ng/劑。8、地鼠腎細胞蛋白質(zhì)殘留量測定：依法進行地鼠腎細胞蛋白質(zhì)殘留量測定，結果應不高于24µg/劑。9、無菌檢查：依法進