臨床基因擴增檢驗質(zhì)量保證

1、臨床基因擴增檢驗的質(zhì)量保證,衛(wèi)生部臨床檢驗中心 李金明,質(zhì)量保證(Quality Assurance,QA),為一產(chǎn)品或服務滿足特定質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計劃的和系統(tǒng)的措施。,室內(nèi)質(zhì)量控制（Internal Quality Control,IQC)的概念,由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結(jié)

2、果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作?？筛爬?(1)執(zhí)行者：實驗室技術(shù)人員；(2)目的：監(jiān)測實驗室測定的重復性；(3)功能：決定了當批測定的有效性，報告可否發(fā)出。是對實驗室測定的即時性評價。,室間質(zhì)量評價（External Quality Assessment, EQA）,為客觀比較一實驗室的測定結(jié)果與靶值的差異，由外單位機構(gòu)，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實驗室之間的結(jié)果具有可比性。這是對實驗

3、室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定在實時的測定結(jié)果的可接受性。當EQA用來為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒炇艺J證的目的而評價實驗室操作時，常描述為實驗室能力驗證（Proficiency testing, PT）。在以前的文獻中，EQA常描述室間質(zhì)量控制。,批 (Run),在相同條件下所獲得的一組測定。,定 義,正態(tài)分布(Gaussian distribution) 當一質(zhì)控物用同一方法在不同的時間重復多次測定，當測定數(shù)據(jù)足夠多時，如以

4、橫軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中相應測定值的個數(shù)，則可得到一個兩頭低，中間高，中為所有測定值的均值，左右對稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。,正態(tài)分布的基本統(tǒng)計學含義可用均數(shù)（X）、標準差（s）和概率來說明。,臨床基因擴增檢驗實驗室常規(guī)測定步驟,標本收集：選擇測定項目、標本收集和保存。實驗室測定：標本接收、貼標簽、樣本處理、核酸擴增、產(chǎn)物檢測、測定的有效性和臨床診療價值。報告和解釋：結(jié)果發(fā)出、結(jié)果解釋和臨床管理。,

5、質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評之間的關(guān)系,臨床標本收集、運送、保存及其質(zhì)量控制,標本收集 標本保存標本運送,標本收集,標本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響 標本采集部位的準備 標本的類型和采集量 采樣質(zhì)量的評價 采樣及運輸容器 標本采集中的防污染,標本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響,在疾病發(fā)展過程中，標本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結(jié)果。,標本采集部位的準備,血液標本采集分泌物標本:采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物

6、或其它雜物,但應適度,過度清潔消毒有可能會去掉或破壞靶微生物,故標本采集部位的準備應由訓練有素的人員進行。,標本的類型和采集量,標本的類型: 血清(漿)、分泌物、痰、糞便、尿和腦脊液等。標本的采集量:應根據(jù)所測病原體而定。一般來說，如果標本的量對病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴增檢測。對于定量測定來說，對標本的收集要求更為精確。,采樣質(zhì)量的評價,血清(漿)標本:溶血、脂血等；分泌物、痰：評價內(nèi)容包括細胞組成

7、，所需類型細胞的數(shù)量和核酸總量。 評價方法：包括肉眼觀察,顯微鏡下觀察和化學分析等。,采樣及運輸容器,標本的采集材料如棉簽應為一次性使用；采樣及運輸容器應為密閉的一次性無菌裝置；采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應對核酸擴增及檢測過程造成干擾。,標本采集中的防污染,采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細胞、痰液等； 如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RNase失活。,標本保存,靶核酸(尤其是RNA

8、)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標本的保存對于核酸擴增測定的有效性極為重要。 使用GITC作為穩(wěn)定劑保存標本，標本可在室溫下穩(wěn)定約7天。,標本保存,臨床體液標本長期保存應在-70℃下。 如為提取核酸后用于DNA擴增分析的樣本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5～8.0)緩沖液中4 ℃下保存。 用于RNA擴增分析的樣本，則應于上述緩沖液中-80℃或液氮下保存。 核酸的乙醇沉淀物則可于-20℃下

9、保存。,標本運送,樣本一經(jīng)采集，則應盡可能快的送至檢測實驗室。樣本中如加入了適當?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運送或郵寄。實驗室應根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運送條件作出相應的規(guī)定。,臨床基因擴增檢驗的室內(nèi)質(zhì)量控制,測定前的質(zhì)量控制核酸樣本的制備及其質(zhì)量控制 統(tǒng)計學質(zhì)量控制質(zhì)量控制的評價,測定前質(zhì)量控制,實驗室設施、儀器設備及管理理想的試劑和

10、操作方法 人員培訓,實驗室設施、儀器設備及管理,臨床基因擴增檢驗實驗室應有充分合理的空間、良好的照明和空調(diào)設備 ；實驗室儀器設備應保養(yǎng)良好，實驗用品要達到相應的要求。加樣器的校準？帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢？離心機？熱循環(huán)儀？水浴箱和/或恒溫干浴儀？酶標儀和洗板機？,理想的核酸擴增實驗室設計A,,理想的核酸擴增實驗室設計B,核酸擴增檢測實驗室設計的一般原則,各區(qū)獨立注意風向因地制宜方便工作,“十六字口訣”,A,B,傳遞窗,

11、傳遞窗,傳遞窗,,“無基因”或“無核酸”概念的重要性,基因擴增儀器設備的質(zhì)控,帶濾芯吸頭的使用及質(zhì)檢,首先制備一個含1～2%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸頭的最大體積為100μl，則將加樣器吸取體積調(diào)至110～120μl，再套上吸頭后吸取上述有色液體。如果吸頭質(zhì)量好，則有色液體不應出現(xiàn)在濾芯之上，否則說明濾芯不嚴。,核酸提取用離心管質(zhì)檢,離心管PCR抑制物質(zhì)檢其他,擴增儀孔間溫度的重復性和均一性的檢測方法,一是使用一種熱電偶

12、探針、微伏轉(zhuǎn)換器和自動圖示記錄儀組成擴增加熱模塊孔內(nèi)溫度監(jiān)測記錄系統(tǒng)，當孔間溫度變異超出1℃時，其可測出來。具體做法是將裝有TE緩沖液并上加石蠟油的擴增反應管放置于擴增儀各孔中，熱電偶探針透過擴增反應管蓋插至緩沖液中，然后按程序進行一個常規(guī)的PCR擴增，加熱模塊如為96孔，則至少要測定12孔不同位置孔內(nèi)的溫度，在整個擴增過程中，可移動熱電偶探針至上述不同孔中監(jiān)測溫度，但每一孔內(nèi)溫度監(jiān)測至少要有一個擴增周期。,擴增儀孔間溫度的重復性和

13、均一性的檢測方法,第二種方法并非直接測定孔內(nèi)溫度，而是通過擴增功能來間接獲知孔間的均一性，即將加有一已知的含一定濃度的陽性質(zhì)控樣本的擴增反應管置于擴增儀各孔中按常規(guī)進行擴增檢測，觀察結(jié)果的一致性程度，如果有某一個或幾個孔結(jié)果有問題，則應確定這一個或幾個孔是否會重復性地得到假陰性結(jié)果，如果是，則表明相應孔的熱傳導有損壞。,理想的試劑和操作方法,試劑盒的質(zhì)檢定量測定的精密度是測定組成步驟的變異和的平方根(SD)= 上式中SDa、SDb

14、、SDc是步驟a、b、c等（例如試劑準備、標本采集、核酸提取、擴增和產(chǎn)物檢測等）的標準差,,理想的試劑和操作方法,改善測定精密度的措施必須首先著重在最不精密的步驟上，應對試劑準備、標本收集、核酸提取、測定方法和儀器操作寫出“標準操作程序”(SOP),實驗室質(zhì)量管理體系的建立,質(zhì)量手冊質(zhì)量體系程序文件標準操作程序(SOP) (相關(guān)記錄表格、報告),存在問題,SOP：形式，缺乏可操作性記錄：檢查型。多而雜。質(zhì)控：形式或沒有

15、分析：缺乏。,實驗室質(zhì)量管理的內(nèi)涵,寫你所應做的做你所寫的記錄你已做的分析你已做的,看得見的看不見的,好習慣是生產(chǎn)力習慣即命運思維習慣與行為習慣羅馬不是一天建成的(Rome was not built in a day ),質(zhì)量體系文件的三大特性,法規(guī)性、唯一性和適用性。法規(guī)性:是指文件一旦制定完成并批準實施，就必須認真執(zhí)行，按照相應的文件去完成日常檢驗工作，也就是前面所說的做你所寫的。并且文件的修改不能隨意，只能按

16、規(guī)定的程序進行。唯一性:則是指（1）一個實驗室只能有一個質(zhì)量體系文件系統(tǒng)；（2）一項檢驗活動只能有唯一的操作程序；（3）一項規(guī)定只能有唯一的理解，不產(chǎn)生歧義；（4）只能使用文件的有效版本，無效版本在實驗室的任何地方都不能使用。適用性:是指質(zhì)量體系文件無統(tǒng)一格式；無標準文本；怎么做怎么寫，切合實際，具有可操作性，不拘一格。所有文件的規(guī)定均應保證在臨床實際檢測工作中能完全做到。當發(fā)現(xiàn)文件有不適合情況時，則應立即按規(guī)定程序?qū)ξ募M行修改。

17、,SOP等于試劑盒說明書嗎？,怎樣編寫SOP？,SOP （5W和1H）,誰來做(Who)： 責任人做什么(What)：適用范圍何時（When）：適用范圍何地（Where）：適用范圍為什么做（Why）：目的如何做（How）：操作步驟,實驗記錄表格的設計,存在問題,表格種類繁多重復記錄表格無實用性，用于檢查的痕跡很重,記錄表格設計的基本原則,信息充分簡單明了臨床標本的檢測信息能有機聯(lián)系起來融入LIS系統(tǒng)？,臨床PC

18、R檢驗流程記錄表 檢驗日期 檢驗項目： 擴增儀中保存文件名： 使用說明：1．本記錄表須嚴格遵循試劑準備區(qū)?標本制備區(qū)?擴增區(qū)（產(chǎn)物分析區(qū)）單一流向移動，嚴禁逆向移動。2．各項工作執(zhí)行后，在相應敘述前的“?”內(nèi)打“?”。3．本記錄表最后與相應的標本接收記錄等歸檔保存于擴增區(qū)的專用文件柜內(nèi)，以備查找。,實驗前準備? 試劑在有效期內(nèi) ? 擴增

19、儀、加樣器和溫度計在校準的有效期內(nèi)? 生物安全柜的濾膜在使用有效期內(nèi) ? 消毒溶液在有效期內(nèi)? 洗眼器內(nèi)無菌生理鹽水在有效期內(nèi) ? 離心管、帶濾芯吸頭已經(jīng)過質(zhì)檢合格 操作者：,試劑準備區(qū)（1區(qū)）實驗前

20、： ? 打開通風設備 ? 實驗臺面清潔（水或70%酒精擦拭）? 冰箱溫度：冷藏室（2~8℃） ℃； 冷凍室（?18℃?2℃） ℃? 實驗室溫度： ℃（允許范圍：10~30℃）；相對濕度： （允許范圍：30%~80%）PCR試劑來源： （可直接列出有關(guān)廠家名稱） 批號：XXXXXXX 檢驗項目：

21、 本次實驗用量： 人份，剩余量： 人份。其他有關(guān)試劑配制：? 按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP配制1%含氯消毒液 毫升；? 按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP配制4％NaOH溶液 毫升；? 按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯 毫升；? 按XXX（將有關(guān)SOP

22、編號列出）SOP配制 毫升；? 其他： 儀器設備使用：離心機：? 正常 ? 不正常 振蕩器：? 正常 ? 不正常 超凈臺：? 正常 ? 不正常實驗后：? 按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP清潔實驗室臺面、地面、加樣器和離心機，并進行紫外照射30分鐘以上。? 按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP處理實驗廢棄物。

23、 操作者：,標本制備區(qū)（2區(qū)）實驗前： ? 打開通風設備 ? 實驗臺面清潔（水或70%酒精擦拭）? 冰箱（柜）溫度：冷藏室（2~8℃） ℃； 冷凍室（?18℃?2℃） ℃? 實驗室溫度： ℃（允許范圍：10~30℃）；相對濕度： （允許范圍：30

24、%~70%）陽性室內(nèi)質(zhì)控物來源： 濃度及批號： 擴增位置： 陰性室內(nèi)質(zhì)控物來源： 批號： 擴增位置： 所取理的標本（對應標本接收的唯一編號）及擬擴增位置：191725 334149 … …2101826 3442503

25、111927 3543514122028 3644525132129 3745536142230 3846 5471523313947 5581624324048 56核酸提取及加樣過程：按XXX（列出編號）SOP進行。儀器設備使用： 生物安

26、全柜：? 正常 ? 不正常 恒溫儀溫度校準： ℃離心機：? 正常 ? 不正常 振蕩器：? 正常 ? 不正常實驗后：? 按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP清潔實驗室臺面、地面及儀器設備。? 按XXX（將有關(guān)SOP編號列出）SOP處理實驗廢棄物。 操作者：

27、,另外兩個存在較多問題的檔案記錄,人員的技術(shù)檔案：一人一個檔案（包括個人基本情況；學歷、學位、任職資格、培訓證、上崗證、榮譽證書等的復印件；論文、著作、成果等的目錄和必要的證明文件復印件；培訓考核的記錄等。）儀器設備的技術(shù)檔案：一臺儀器一個檔案（包括儀器基本情況，如儀器設備名稱、型號、序列號、生產(chǎn)廠家、購置日期、啟用日期、目前放置地點、責任人等；儀器校準的記錄（本次校準日期和下次應校準的日期、校準證書或數(shù)據(jù)）；維修維護的歷史記錄；儀

28、器使用說明書、注冊證等的復印件；合格證書；配備的小配件如保險絲、燈泡等）,人員培訓,方法原理核酸擴增檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)儀器設備使用、維護和校準結(jié)果的分析、報告及進一步處理質(zhì)控的分析知其然又知其所以然。,實驗室人員內(nèi)部培訓的重要性,外部培訓提供的是“理念”，是被動的，更多的是“學習”內(nèi)部培訓是主動的，源于實踐，高于實踐，更多的是“思考”,人員培訓,如何培訓的舉例：新購儀器設備的操作培訓,在儀器購買合同中，加入培訓的內(nèi)容：廠家提供

29、培訓計劃培訓計劃應包括：培訓教材（含具體培訓內(nèi)容，如儀器操作及維護校準的SOP、安全性）、培訓者資質(zhì)證明、培訓所需時間與次數(shù)、需要接受培訓方準備的條件（人員、用具和場地等）、培訓合格的考核方法及判斷標準等。培訓后保存所有有關(guān)記錄。,核酸樣本的制備、擴增檢測及其質(zhì)量控制,一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內(nèi)釋出的原理核酸的分離純化靶核酸提取的質(zhì)量 臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì) 核酸樣本制備及擴增檢測的質(zhì)控 產(chǎn)

30、物檢測的質(zhì)控,核酸的分離純化,核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增的物質(zhì)去除。 經(jīng)典方法硅吸附法對于商品核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進行評價。,臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì),臨床標本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試

31、劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機溶劑 。,對臨床標本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)控措施,質(zhì)控措施： 采用內(nèi)質(zhì)控（internal control, IC）（通常稱為內(nèi)標）的方法 內(nèi)標有兩種,即競爭性的和非競爭性的內(nèi)標。,核酸提取及擴增有效性的質(zhì)控,已知弱陽性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）：至少帶1份，其最后的檢測結(jié)果，應是核酸提取和擴增檢測的有效性的綜合反映。已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）：至少帶1份，擴

32、增測定的結(jié)果可以判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染。,室內(nèi)質(zhì)控方法,非統(tǒng)計學方法統(tǒng)計質(zhì)控方法,非統(tǒng)計學方法,在檢測血液標本的同時，檢測一定數(shù)量（與臨床樣本的數(shù)量相適應）的已知弱陽性（與試劑宣稱的測定下限相適應）和陰性的質(zhì)控樣本檢測有效的質(zhì)控判斷方法：陽性檢測為陽性（反應性），陰性檢測為陰性（非反應性）。,統(tǒng)計學質(zhì)量控制,理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件測定中質(zhì)控樣本的設置、數(shù)量及排列順序 統(tǒng)計學質(zhì)控的特點 統(tǒng)計質(zhì)控方法,理想的室內(nèi)質(zhì)控

33、樣本的條件,基質(zhì)與待測樣本一致；所含待測物濃度接近試驗的決定性水平；穩(wěn)定；靶值或預期結(jié)果已定；無已知的生物傳染危險性；單批可大量獲得；價廉,測定中質(zhì)控樣本的設置、數(shù)量及排列順序,標本量不大，如少于30份，定性測定有1份接近cut-off的弱陽性和1份陰性質(zhì)控樣本應可以滿足要求。樣本量大，則可按比例增加。定量測定則要根據(jù)試驗的測定范圍，采用高、中、低三種濃度的質(zhì)控樣本。核酸提取時，質(zhì)控樣本要隨機放在臨床標本中間。至于在測

34、定中的排列順序，可排于標準品或校準品之后，臨床樣本之前。,臨床基因擴增檢驗室內(nèi)質(zhì)控的獨特性,即監(jiān)測污染發(fā)生的陰性質(zhì)控的設置。 可包括1份陰性原血清樣本、1份在標本核酸提取過程中帶入的一個空管和僅含擴增反應混合液的管。,陰性原血清質(zhì)控樣本的功能,監(jiān)測實驗室的以前擴增產(chǎn)物的污染； 由實驗操作所致的標本間的交叉污染；擴增反應試劑的污染。,在標本核酸提取過程中帶入的一個空管的功能,監(jiān)測實驗操作過程中的實驗室污染和標本間交叉污染.不能取

35、代原血清陰性樣本。,僅含擴增反應混合液的管的功能,監(jiān)測擴增試劑是否發(fā)生污染，具有較強的污染鑒別性。,實驗室是否發(fā)生污染的鑒別,可將一個或多個空管打開靜置于標本制備區(qū)30～60分鐘，然后加入擴增反應混合液同時以水替代核酸樣本擴增，如為陽性，而上述僅含擴增反應混合液的管為陰性，則說明實驗室以前擴增產(chǎn)物的存在。,統(tǒng)計學質(zhì)控的特點,檢驗誤差有兩類，一是系統(tǒng)誤差，一是隨機誤差。系統(tǒng)誤差通常表現(xiàn)為質(zhì)控物測定均值的漂移，是由操作者所使用的儀器設備、

36、試劑、標準品或校準物出現(xiàn)問題而造成的，這種誤差可以通過前述的措施方法加以控制，是可以排除的。隨機誤差則表現(xiàn)為測定SD的增大，主要是由實驗操作人員的操作等隨機因素所致，其出現(xiàn)難以完全避免和控制。,統(tǒng)計學質(zhì)控的功能,統(tǒng)計學質(zhì)控的功能就是發(fā)現(xiàn)誤差的產(chǎn)生及分析誤差產(chǎn)生的原因，采取措施予以避免。開展統(tǒng)計質(zhì)量控制前，應將可以控制的誤差產(chǎn)生因素盡可能地加以控制，這不但是做好室內(nèi)質(zhì)控的前提，也是保證常規(guī)檢驗工作質(zhì)量的先決條件。,統(tǒng)計質(zhì)控方法,基線測

37、定質(zhì)控規(guī)則的表達方式及定義 Levey-Jennings質(zhì)控圖方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法 “即刻法”質(zhì)控方法,基線測定,最佳條件下的變異（Optimal conditions variance, OCV）和常規(guī)條件下的變異（Routine conditions variance, RCV）； 當RCV與OCV接近，或小于2 OCV時，則RCV是

38、可以接受的。以上為批間變異。批內(nèi)變異的測定；室內(nèi)質(zhì)控物的測定準確度的評價。,臨床基因擴增檢驗IQC統(tǒng)計計算問題,可使用質(zhì)控樣本擴增后的IU/ml來進行統(tǒng)計計算，也可用其對數(shù)值進行。由于基因擴增結(jié)果的原始數(shù)據(jù)通常很大，故使用其對數(shù)值來進行質(zhì)控統(tǒng)計分析可能要更為方便一些。,質(zhì)控規(guī)則的表達方式及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達方式 質(zhì)控規(guī)則的功能 常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達方式,通常質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質(zhì)控測定

39、中超出質(zhì)量控制限的測定值的個數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值±1～3SD來表示。 當質(zhì)控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。 常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值±3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測定值中，如果有一個測定值超出均值±3s范圍，即可將該批測定判為失控。,質(zhì)控規(guī)則的功能,簡單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控 。,常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義,符 號

40、 定 義12S 一個質(zhì)控測定值超出±2s控制限。13S 一個質(zhì)控測定值超出±3s控制限。22S 兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或－2s控制限。R4S 同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的 差值超出4s控制限。41S 四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或

41、－1s控制限。7T 七個連續(xù)的質(zhì)控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變 化。10X 十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（X）的同一側(cè)。,Levey-Jennings質(zhì)控圖方法,也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國的Shewhart 于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。二十世紀五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質(zhì)量控制 。經(jīng)Henry和Segalo

42、ve的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。,Levey-Jennings質(zhì)控圖,,Levey-Jennings質(zhì)控圖基本的統(tǒng)計學含義,穩(wěn)定條件下，在20個IQC結(jié)果中不應有多于1個結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個。如以±3s為失控限，假失控的概率為0.3%。,“假陽性”的統(tǒng)計學室內(nèi)質(zhì)控方法,基于日常檢驗的陽性率比值(呈正態(tài)分布

43、)直接概率計算方法（不呈正態(tài)分布）,“即刻”質(zhì)控方法,“即刻法” 的實質(zhì)是一種統(tǒng)計學方法,即Grubs異常值取舍法 只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。,室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)的評價,IQC為一集體活動，除實際測定者外，還應有另外一人對測定數(shù)據(jù)進行質(zhì)檢。不能將IQC作為一個監(jiān)察方法，當發(fā)現(xiàn)一次測定未達到質(zhì)量標準時，應以建設性的而非批評的方式去探查失控的原因。除了將IQC數(shù)據(jù)作為日常質(zhì)控外，還應定期評價累積數(shù)據(jù)以監(jiān)測在測定操

44、作中的長期變化趨勢。評價應定期進行。,分析你已做的,每次實驗結(jié)果的分析 表象與真象多次實驗結(jié)果的綜合分析 趨勢的內(nèi)在含義儀器設備的使用情況分析 維護與校準周期的有效性,弱陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因,核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留等。 儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。 試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、

45、探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率等。,陰性質(zhì)控樣本的失控原因,主要為擴增產(chǎn)物的“污染”和/或臨床標本的核酸提取過程中發(fā)生的標本間的交叉 “污染”,一個臨床PCR實驗室對全年室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果的分析舉例,IQC的局限性,IQC可能測不出的誤差 測定前 　 測定中　 　測定后　 樣本鑒定不對　 樣本吸取不對 結(jié)果記錄錯誤 樣本貯存中變質(zhì)　　 試劑加入不對此類誤差的發(fā)生率在

46、不同的實驗室有所不同，一般要求小于 0.1%，且應均衡地分布于測定前、測定中和測定后的不同階段。,影響臨床基因擴增檢驗結(jié)果的最關(guān)鍵因素,產(chǎn)物“污染”（Carry-over)測定人員的操作：標本混淆；貼錯標簽、核酸提取等試劑,避免基因擴增檢驗假陽性結(jié)果的措施,嚴格的實驗室分區(qū)；使用帶“濾芯”的吸頭；設立“陰性”質(zhì)控（與標本同時處理）；使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑；臨床“假陽性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌

47、經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測。,避免基因擴增檢驗假陰性結(jié)果的措施,避免由于來自于標本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標本處理中的去垢劑、有機溶劑的抑制作用的措施：（1）純化核酸；（2）標本重復雙份測定；（3）稀釋標本。使用“內(nèi)質(zhì)控”（Internal Control,IC)以避免由于試劑、擴增儀或標本處理不當所致的假陰性；須注意的是，如果靶濃度很高，可致在靶核酸和IC之間產(chǎn)生競爭，而

48、使IC受抑制，此時IC可為陰性。,室間質(zhì)量評價（EQA）,EQAProficiency testing (PT),EQA 的程序設計,確定質(zhì)評方案,定期發(fā)放質(zhì)評樣本；要求參加質(zhì)評實驗室報告結(jié)果的單位要一致，以便于統(tǒng)計；報告要清楚、簡潔； 要求參評實驗室在測定EQA樣本時，要以與常規(guī)樣本完全相同的方式測定； 對測定方法、試劑及儀器等歸納總結(jié)；對參評實驗室的測定要有評價； EQA報告要迅速及時。,EQA質(zhì)評樣本,樣本特征與患

49、者樣本應盡量一致樣本濃度與試驗的臨床應用相適應在樣本發(fā)放的條件下穩(wěn)定不存在不可避免的傳染危險性,EQA靶值,定性測定，應為明確的陰性或陽性定量測定，則提供參考方法值或參加實驗室的修正均值或參考實驗室均值或方法或歸組的方法均值,評價方法,特定參評實驗室的評分根據(jù)其與其它實驗室得分之間的關(guān)系，可分為絕對評分和相對評分兩種模式。 絕對評分就是根據(jù)已定的靶值對參評實驗室測定的每份質(zhì)評樣本計分，然后再計算該次質(zhì)評的總分，以得分的高低評

50、價參評實驗室的水平。 相對評分則是將參評實驗室質(zhì)評得分與所有參評實驗室的平均分進行比較，觀察其得分在全部參評實驗室中所處的位置。,相對評分和絕對評分的例子,相對評分：英國NEQAs絕對評分：美國CAP,采用何種評分方法較好？,建立一個質(zhì)評體系，上述絕對評分和相對評分的方法均可以采用，其實質(zhì)內(nèi)容并無太大的差別，只不過是表現(xiàn)形式的不同，尤其是在定量測定。從室間質(zhì)量評價對改善實驗室測定質(zhì)量的作用來看，究竟是采用上述哪一種或另外制定的評價

51、方法其實并不重要，關(guān)鍵是要有一個評價方法，從而以其為標準去評價實驗室的測定。,EQA對測定技術(shù)的評價,使用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法全面地對方法、試劑和單個參評實驗室測定技術(shù)進行評價指明嚴重誤差適當時評價測定的其它方面（如測定干擾）。,EQA的局限性,參評實驗室沒有同等的對待EQA樣本和患者樣本可能會妨礙給出不同結(jié)果的改良方法的發(fā)展在不同的EQA程序中，對實驗室的評價可能不同,染色體差異1.23%(Fujiyama A,et al.