hpv檢測(cè)目的及最佳檢測(cè)方法

1、HPV病毒檢測(cè)的目的及最佳檢測(cè)方法,,1、HPV檢測(cè)的目的是什么？2、HPV檢查的最佳方法？3、德同產(chǎn)品介紹,2,主要內(nèi)容,■ 只是為了查有沒(méi)有HPV病毒感染？ ■ 是為了查HPV感染型別，檢測(cè)型別越多越好？ ■ 是為了發(fā)現(xiàn)已經(jīng)存在的CIN2+病變和預(yù)CIN2+ 的 風(fēng)險(xiǎn)人群？,3,HPV檢測(cè)的目的是什么？,專(zhuān)家對(duì)HPV檢測(cè)是否要臨床驗(yàn)證如何看待？,HPV檢測(cè)的目的是什么？,1個(gè)HIV/HBV = AIDS/

2、HBV1個(gè)HPV ≠ CIN或?qū)m頸癌 （80-90%的女性HPV感染是一過(guò)性的，可在6-24個(gè)月通過(guò)自體免疫清除）高危型HPV持續(xù)感會(huì)導(dǎo)致宮頸癌從HPV感染到宮頸癌，一般需要10－20年,高分析敏感度,檢測(cè)與臨床無(wú)關(guān)的病毒水平（假陽(yáng)性）,一過(guò)性的感染會(huì)自身清除,恢復(fù)階段：免疫響應(yīng),早期感染會(huì)自身清除,Snijders et al. Journal of Pathology 2003; 201:1-6,HPV檢測(cè)的目的是什么？,H

3、PV病毒含量與臨床病變的關(guān)系,WHO指南對(duì)于HPVCutoff有明確推薦檢測(cè)陽(yáng)性判斷值,6,WHO guidelines for screening and treatment of precancerous lesions for cervical cancer prevention. © World Health Organization 2013,陽(yáng)性判斷值（Cutoff）的設(shè)定，在2013年的WHO宮頸癌篩查和管理指南

4、中是有具體建議的，其推薦高危型HPV 檢測(cè)cut-off 值≥1.0 pg/ml,HPV檢測(cè)的目的是什么？,HPV檢測(cè)的目的是什么？,HPV檢測(cè)的目的是什么？,7,不再是單純的病毒檢測(cè)，而是強(qiáng)調(diào)“臨床”，不再是制造商說(shuō)了算，而是臨床說(shuō)了算陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)是要獲得理想臨床敏感度和特異度的臨界值，制造商不能僅憑簡(jiǎn)單的病毒檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)制定，建議使用ROC曲線的方式進(jìn)行評(píng)估，這需要大量臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)才能最終找到理想的臨界值,2015年CFDA針對(duì)HP

5、V檢測(cè)試劑陽(yáng)性判斷值的規(guī)定：臨床靈敏度特異度的Cutoff值,HPV檢測(cè)的目的是什么？,8,2015年歐洲IPV大會(huì)：宮頸癌篩查HPV檢測(cè)目的HPV檢測(cè)不是為了檢測(cè)病毒，不是一過(guò)性感染，而是檢測(cè)感染病毒后的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)HPV檢測(cè)需要關(guān)注臨床敏感度，最大化的保護(hù)低風(fēng)險(xiǎn)人群，最大化的辨別高風(fēng)險(xiǎn)人群,2015 IPV Conference，Mark. Stoler,2016年CSCCP會(huì)議,Greater China Commerical S

6、ummit,9,HPV檢測(cè)不是僅僅為了檢出HPV感染，而是為了發(fā)現(xiàn)已經(jīng)存在的CIN2+病變和預(yù)測(cè)CIN2+的風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)于HPV檢測(cè)來(lái)說(shuō)，最重要的是臨床靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值,HPV檢測(cè)的目的是什么？,WHO / IRAC 明確檢測(cè)13種HPV,Title, Location, Date,10,從流行病學(xué)和致癌機(jī)制證據(jù)方面，WHO/IRAC 明確檢測(cè)13種HPV型別：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59

7、、68,最強(qiáng)的致癌型別，幾個(gè)致癌位點(diǎn)已經(jīng)明確,充足流行病學(xué)證據(jù)證實(shí)會(huì)導(dǎo)致宮頸癌,缺乏宮頸癌流行病學(xué)證據(jù)，但從致癌機(jī)制上有強(qiáng)的證據(jù)支持,2009 WHO IARC Special Report Policy A review of human carcinogens Part B,2015年中國(guó)CFDA明確HPV檢測(cè)型范圍,11,HPV檢測(cè)型別太少的產(chǎn)品如只檢測(cè)5種型別、2種型別（如HPV16/18）等，將不能再注冊(cè),HPV檢測(cè)的目的是什

8、么？,HPV檢測(cè)的目的是什么？,Title, Location, Date,12,不能盲目的追求過(guò)多的HPV檢測(cè)型別不建議將低危型HPV檢測(cè)用于宮頸癌篩查,中國(guó)CFDA明確限制低危型HPV檢測(cè),2015最新CFDA指導(dǎo)原則以服務(wù)臨床為最終目的,13,一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，要想滿(mǎn)足以上要求，必須基于長(zhǎng)時(shí)間大量的臨床驗(yàn)證才能實(shí)現(xiàn),2015年CFDA新的指導(dǎo)原則，從臨床目的出發(fā)，精確注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求,答案： ■只是為了查有沒(méi)有HPV病毒感染？NO

9、 ■是為了查HPV感染型別，檢測(cè)型別越多越好？NO ■是為了發(fā)現(xiàn)已經(jīng)存在的CIN2+病變和預(yù)CIN2+ 的風(fēng)險(xiǎn) 人群？yes,14,HPV檢測(cè)的目的是什么？,1、HPV檢測(cè)的目的是什么？2、HPV檢查的最佳方法？3、德同產(chǎn)品介紹,15,主要內(nèi)容,HPV檢查的最佳方法,直接核酸檢測(cè)（無(wú)需PCR實(shí)驗(yàn)室）雜交捕獲技術(shù) （HC2、DH1、DH2、DH3）酶切信號(hào)放大法 （Cervista）核酸擴(kuò)增后檢測(cè)——PCR類(lèi)技

10、術(shù)（需PCR實(shí)驗(yàn)室） 膜雜交法 基因芯片法 反向點(diǎn)雜交法 流式熒光雜交法 熒光探針?lè)?HPV DNA檢測(cè)技術(shù)分類(lèi),HPV檢查的最佳方法雜交捕獲技術(shù) （HPV檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)）產(chǎn)品德國(guó)凱杰的：HC2杭州德同的：DH2、DH3,17,HPV檢查的最佳方法,雜交捕獲技術(shù) 的三大優(yōu)勢(shì)：1、獨(dú)特的探針技術(shù)：14 種全長(zhǎng) 8000RNA 探針，避免因 區(qū)域片段（如 L1 區(qū)）丟失造成的假陰性2、無(wú)需DNA提取，無(wú)需

11、核酸擴(kuò)增，有效避免因環(huán)境因素造 成的假陽(yáng)性3、統(tǒng)一的臨 床 判 定 標(biāo) 準(zhǔn)≥1.0pg/ml，避 免 因方法 學(xué)靈敏度過(guò)高產(chǎn)生的假陽(yáng)性，結(jié)果重復(fù)性好，準(zhǔn)確可靠。,18,HPV檢查的最佳方法,雜交捕獲法獨(dú)特的探針技術(shù),HPV病毒基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，含有~8000個(gè)堿基對(duì),德同DH系列 HPV 檢測(cè)“全長(zhǎng)雞尾酒”探針技術(shù),HPV18,8000bp，基于全長(zhǎng)，涵蓋HPV DNA所有區(qū)域2＋12種不同型別探針混合準(zhǔn)確，不漏

12、診,Cobas HPV& Abbott HPV(12+2 Real-time PCR)“寡核苷酸探針”技術(shù),HPV16,,HPV18,,12種HR通用探針,約200bp，僅基于L1片斷， 非全長(zhǎng)僅3種探針混合病毒基因缺失、突變會(huì)造成漏診,,,其他國(guó)產(chǎn)PCR方法“ 寡核苷酸探針”技術(shù),13種HR通用探針,,約100-150bp，僅基于L1片斷， 非全長(zhǎng)僅1種通用探針病毒基因缺失、突變會(huì)造成漏診,H

13、PV16,,12種HR通用探針,,,德同DH系列HPV 檢測(cè)“全長(zhǎng)雞尾酒”探針技術(shù),Title, Location, Date,,Cobas HPV& Abbott HPV(12+2 Real-time PCR)“寡核苷酸探針”技術(shù),其他國(guó)產(chǎn)PCR方法 “寡核苷酸探針”技術(shù),PCR和HC2的臨床敏感性比較：綜合1999-2005年間的主要研究 基于CIN2/3/癌癥的病例數(shù)〉1,500,%,,,,“L1片段的缺失并不普遍

14、，但是任何變異或缺失都會(huì)造成PCR的檢測(cè)結(jié)果為陰性…” Unger et al JHC 1998, 46(4): 535-540,“L1片段是病毒衣殼蛋白，在HPV病毒引發(fā)的腫瘤進(jìn)展過(guò)程中是不必要的，因此很可能在HPV整合過(guò)程會(huì)導(dǎo)致L1片段的缺失” Capone et al, Clin Cancer Research 2000, 6:4171-4175,“~5%的癌癥和CIN3會(huì)因?yàn)镠PV L1片段的缺失而無(wú)法被檢測(cè)出來(lái)” Lo

15、rincz (Methods for HPV Detection) ; Emerging Issues on HPV Infections: From Science to Practice, Monsonego 2006,HPV 病毒基因L1片段缺失,PCR中β-球蛋白的競(jìng)爭(zhēng),反應(yīng)過(guò)程中的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,“β-球蛋白和HPV以共同引物L(fēng)1片段進(jìn)行擴(kuò)增，這樣會(huì)降低HPV檢測(cè)的敏感度”Coutlee et al. JCM 200

16、2; 40(3): 902-907,PCR導(dǎo)致假陰性的原因,不同HPV型別擴(kuò)增效率不同如果L1片段缺失，檢測(cè)失敗 (整合型HPV)通用引物會(huì)和低危型HPV結(jié)合，抑制了目標(biāo)高危型別的擴(kuò)增內(nèi)指控（Beta-globin）會(huì)抑制HPV擴(kuò)增樣本抑制 (有5％的樣品丟失因出現(xiàn)抑制而無(wú)法擴(kuò)増),PCR檢測(cè)可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,檢測(cè)與臨床不相關(guān)的感染樣本間的污染,缺乏統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果受主觀因素影響,雜交捕獲,PCR,經(jīng)臨床驗(yàn)證的同一判定

17、標(biāo)準(zhǔn)1.0pg/ml儀器判讀、結(jié)果客觀可靠,統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn),HPV檢查的最佳方法,為何要明確“臨床靈敏度和臨床特異度的Cutoff值”？,26,2015 IPV Conference，Mark. Stoler,參考2015年世界IPV大會(huì)：理想的臨床靈敏度和特異度的臨界值（Cutoff），即及能夠保證對(duì)≥CIN2的病人具有非常高的檢出率的同時(shí)，又可以避免因分析敏感度過(guò)高而造成的假陽(yáng)性臨床敏感度與疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)掛鉤分析敏感度與是否存

18、在病毒感染掛鉤：PCR過(guò)于敏感的分析敏感度，會(huì)將病毒含量的人判斷為陽(yáng)性,,,HPV檢查的最佳方法,Adapted from Snijders et al. Journal of Pathology 2003; 201:1-6,分HPV檢查的最佳方法析敏感度與臨床敏感度,雜交捕獲 HPV DNA檢測(cè)為陰性時(shí)并不代表體內(nèi)沒(méi)有HPV，表明樣品中HPV含量不足5000拷貝.雜交捕獲 HPV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性時(shí)（高于以上標(biāo)準(zhǔn)）可以預(yù)測(cè)未來(lái)8

19、-10內(nèi)患CIN2/3或者進(jìn)展為更高級(jí)別病變的風(fēng)險(xiǎn)短暫及一過(guò)性的感染會(huì)通過(guò)自身免疫力清除PCR 方法檢測(cè)HPV的分析敏感度可能 <10 拷貝,區(qū)別：分析敏感度與臨床敏感度,分析敏感度,,,PCR 方法的分析敏感度達(dá)到10個(gè)拷貝/ml,陽(yáng)性結(jié)果：可能沒(méi)有臨床相關(guān)性,,臨床敏感度,,,雜交捕獲的分析閾值經(jīng)臨床驗(yàn)證為 5,000 個(gè)拷貝/ml,經(jīng)臨床證實(shí)：高度的陰性預(yù)測(cè)值,,樣本中能檢測(cè)出的病毒最低水平 也被稱(chēng)作檢測(cè)極限

20、(LOD) 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：檢測(cè)結(jié)果與零的區(qū)分,以臨床病變?yōu)榻K點(diǎn)指征，檢測(cè)出高度病變的敏感度 (CIN3+ / SCC) 初篩時(shí)，能夠檢測(cè)出CIN2＋或?qū)m頸癌的比例 分析閾值必須得到嚴(yán)格的驗(yàn)證,HPV檢查的最佳方法雜交捕獲技術(shù) （HPV檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)）產(chǎn)品德國(guó)凱杰的：HC2杭州德同的：DH2、DH3,29,HPV檢查的最佳方法,1、HPV檢測(cè)的目的是什么？2、HPV檢查的最佳方法？3、德同產(chǎn)品介紹,30,主要內(nèi)容,杭

21、州德同DH系列產(chǎn)品,利用基因雜交、化學(xué)發(fā)光、信號(hào)放大的原理在分子水平檢測(cè)WHO認(rèn)可的14種高危型-HPV 病毒DNA 最新“2+12型”檢測(cè)設(shè)計(jì)(HPV16/ 18 與其他12種型別檢測(cè)),德同產(chǎn)品原理-新一代雜交捕獲技術(shù),杭州德同DH系列產(chǎn)品,具有48T、96T兩種規(guī)格,半自動(dòng)檢測(cè)儀器,全自動(dòng)檢測(cè)儀器,杭州德同DH系列產(chǎn)品檢測(cè)儀器,DH產(chǎn)品與HC2的臨床比對(duì),,,孫小偉等，《中華腫瘤防治雜志》 2016年2月 第23卷 第

22、3期 137-140,,,,河南新密“兩癌”篩查項(xiàng)目,DH2對(duì)CIN2+的檢出率顯著高于巴氏涂片和VIA/VILI,臨床試驗(yàn)顯示：DH3具有與Cobas相同預(yù)測(cè)高級(jí)別病變的效能,浙江龍游10669名健康婦女接受Cobas和DH3篩查結(jié)果比對(duì),臨床試驗(yàn)顯示：DH3與Cobas預(yù)測(cè)高級(jí)別的效能相似,浙江龍游10669名健康婦女HPV16/18分型檢測(cè)用于宮頸癌初篩Cobas/DH3效能的比較,保留了HPV檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”雜交捕獲技術(shù)的特點(diǎn)

23、 全長(zhǎng)探針－減少“漏診” 閾值（cutoff值）1pg/ml－確保檢測(cè)“病變”，而不是檢測(cè)“病毒” 無(wú)核酸擴(kuò)增－無(wú)需實(shí)驗(yàn)室特殊要求及人員資質(zhì) 儲(chǔ)運(yùn)條件：2-8℃新添加最新的設(shè)計(jì) 系列產(chǎn)品：DH2:14種高危HPV DH3:2+12分型檢測(cè) －滿(mǎn)足不同篩查需求 －符合宮頸癌篩查最新理念 全自動(dòng)檢測(cè) — 減輕人員負(fù)擔(dān)