多途徑組合對(duì)魚類精子超低溫冷凍損傷的挽救效應(yīng).pdf

1、目的：從膽固醇、靶向線粒體抗氧化劑MitoQ冷凍保存前導(dǎo)入和解凍復(fù)蘇后導(dǎo)入甲狀腺素這兩方面組合來研究，是否多種途徑共同作用對(duì)魚類冷凍凍精子質(zhì)量有更好的挽救效應(yīng)。
　　方法：DCFH-DA/PI雙染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測精子細(xì)胞內(nèi)ROS水平；JC-1法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位（MMP）；ATP檢測試劑盒結(jié)合多功能酶標(biāo)儀檢測ATP水平；TBA比色法結(jié)合多功能酶標(biāo)儀檢測脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）；Western blot方法檢

2、測蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：T3的添加方式是在精子解凍后直接加入到精子懸液中并在37℃環(huán)境中孵育，T3對(duì)黃顙魚凍精的作用濃度和孵育時(shí)間是7nM120 min時(shí)對(duì)黃顙魚解凍后精子的活力有明顯改善P＜0.05。對(duì)斑馬魚作用的濃度和時(shí)間是10 nM30 min時(shí)對(duì)斑馬魚解凍后精子的活力有改善作用。通過試劑盒檢測 T3對(duì)黃顙魚和斑馬魚凍精生化參數(shù)的影響：經(jīng)過 T3處理過的凍精ATP的含量都有明顯的升高（P＜0.05）,另外處理組MDA，RO

3、S含量下降，MMP水平上升的變化也都相一致。T3對(duì)魚類凍精的UCP2蛋白的表達(dá)并沒有明顯的變化（p≥0.05）。結(jié)果顯示 T3對(duì)黃顙魚和斑馬魚凍精的精子質(zhì)量有一定的改善作用。因此進(jìn)一步研究多重藥物組合對(duì)魚類凍精精子質(zhì)量的影響。CLC和 MitoQ的添加方式是在精子冷凍前將這兩種物質(zhì)添加到精子懸液之后在室溫下孵育15 min后再進(jìn)行冷凍。CLC和MitoQ對(duì)黃顙魚斑馬魚精子冷凍損傷具有明顯的改善作用已經(jīng)得到證實(shí)。因此將T3，CLC和Mit

4、oQ組合方式共CON，T3，CLC，MitoQ，CLC+ T3，MitoQ+ T3，CLC+ MitoQ和 CLC+MitoQ+T38個(gè)組別。T3，CLC，MitoQ單獨(dú)作用時(shí)對(duì)黃顙魚凍精的活力都有明顯的改善作用（p＜0.05），但是兩種或三種聯(lián)合作用與單獨(dú)作用并沒有明顯的差別（p≥0.05）。單獨(dú)作用對(duì)黃顙魚凍精 MDA的產(chǎn)生都有明顯的下調(diào)的作用，聯(lián)合作用時(shí)同樣沒有明顯的差別。另外，單獨(dú)作用及聯(lián)合作用對(duì)黃顙魚凍精 ATP，ROS的產(chǎn)生

5、和MMP都沒有明顯的作用。在黃顙魚的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示，T3實(shí)驗(yàn)組 UCP2表達(dá)水平與其他實(shí)驗(yàn)組相比較有明顯的升高，其他實(shí)驗(yàn)組之間 UCP2的表達(dá)水平并沒有明顯的差別。在斑馬魚結(jié)果顯示所有實(shí)驗(yàn)組間均沒有顯著性的差別（ p≥0.05）， T3+ CLC+MitoQ實(shí)驗(yàn)組相較于其他組UCP2的表達(dá)量有所下降。在黃顙魚實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示 CLC+ MitoQ及與 T3的組合作用對(duì) Na+/K--ATPase的表達(dá)量與其他組相比較有明顯的升高（p＜0.

6、05）。而在斑馬魚結(jié)果中T3及MitoQ+T3實(shí)驗(yàn)組Na+/K--ATPase的表達(dá)量較其他組有所升高。黃顙魚是結(jié)果顯示CLC+MitoQ+T3實(shí)驗(yàn)組ATP citrate lyase的表達(dá)水平與其他實(shí)驗(yàn)組相比較有明顯的升高（ p＜0.05）， CLC+ MitoQ實(shí)驗(yàn)組中Hexokinase的表達(dá)水平與MitoQ及MitoQ+T3實(shí)驗(yàn)組相比較有明顯的升高。斑馬魚凍精實(shí)驗(yàn)結(jié)果中所有處理組中ATP citrate lyase的表達(dá)水平均比

7、較穩(wěn)定， CLC實(shí)驗(yàn)組中 Hexokinase的表達(dá)量較其他實(shí)驗(yàn)組有所上調(diào)，其他實(shí)驗(yàn)組間無明顯的差別（p≥0.05）。黃顙魚實(shí)驗(yàn)結(jié)果中CLC+ T3，CLC+ MitoQ實(shí)驗(yàn)組PARP的表達(dá)水平較其他組相比有所升高，在斑馬魚實(shí)驗(yàn)中 PARP的表達(dá)水平均沒有明顯的差別（p≥0.05）。黃顙魚結(jié)果中 GLUT1的表達(dá)水平均沒有明顯的差異，在斑馬魚中CLC+ MitoQ及CLC+ MitoQ+ T3實(shí)驗(yàn)組GLUT1表達(dá)水平較其他組相比較有所升

8、高，其他組見均沒有明顯差異（p≥0.05）。
　　結(jié)論：T3，CLC，MitoQ對(duì)黃顙魚和斑馬魚凍精的精子質(zhì)量有一定的改善作用。任何兩種藥物聯(lián)合作用后對(duì)精子質(zhì)量的改善作用與單獨(dú)作用時(shí)并沒有明顯差別。三種物質(zhì)聯(lián)合作用與其他實(shí)驗(yàn)組相比較同樣沒有明顯差別。T3對(duì)魚類凍精 UCP2的表達(dá)與其他實(shí)驗(yàn)組相比較有輕微的上調(diào)作用。T3，CLC，MitoQ組合作用對(duì)黃顙魚和斑馬魚凍精的部分代謝蛋白有一定的影響，但是這些蛋白的變化對(duì)魚類凍精精子質(zhì)量的