中華絨螯蟹胚胎超低溫冷凍保存及冷凍損傷機(jī)理研究.pdf

1、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），俗稱(chēng)河蟹、大閘蟹、毛蟹，屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱，在淡水中生長(zhǎng)、海水中繁殖，在我國(guó)很多省市均有分布，是我國(guó)傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖主導(dǎo)當(dāng)家品種。近年來(lái)，隨著自然環(huán)境演變、人類(lèi)生產(chǎn)活動(dòng)和適度捕撈等，我國(guó)尤其是長(zhǎng)江中中華絨螯蟹資源量和種質(zhì)急劇衰退,中下游蟹(在)逐漸消失，遺傳多樣性下降。水生生物配子和胚胎超低溫冷凍保存作為種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的有效途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本課題以中華絨螯蟹胚

2、胎作為研究對(duì)象，首次將玻璃化冷凍方法引入甲殼動(dòng)物胚胎的冷凍保存上，對(duì)中華絨螯蟹胚胎玻璃化冷凍保存技術(shù)和冷凍損傷機(jī)理進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。分別開(kāi)展了單因子抗凍劑的篩選、玻璃化液的篩選、玻璃化冷凍方法的確立、冷凍對(duì)胚胎生化成分的影響、冷凍對(duì)胚胎外部形態(tài)和內(nèi)(部形態(tài))的影響、冷凍對(duì)胚胎線粒體DNA影響等研究,主要研究結(jié)果包括以下幾個(gè)方面:
　　1.中華絨螯蟹胚胎發(fā)育及幾種代謝酶活性的變化
　　采用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)小規(guī)模實(shí)驗(yàn)的方法，在平均水溫

3、（16.2±1.5）℃和鹽度15的條件下，對(duì)中華絨螯蟹胚胎發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)和幾種重要代謝酶的活性變化進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中華絨螯蟹的胚胎發(fā)育過(guò)程可以分為9個(gè)主要階段:受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸期、前無(wú)節(jié)幼體期、后無(wú)無(wú)節(jié)幼體期、原溞狀幼體期、出膜前期和孵化期;平均水溫16℃下，整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程需10d左右，有效積溫達(dá)到10758 h·℃。乳酸脫氫酶(LDH)、總ATPase和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)的活性都隨胚胎發(fā)育時(shí)期的變

4、化而變化，LDH活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在囊胚期中活性最高;總ATPase活性在原溞狀幼體期最高,在原腸期最低;MDH活性在原溞狀幼體期最高，在囊胚期最低。
　　2.抗凍劑對(duì)中華絨螯蟹胚胎成活率的影響
　　采用二甲亞砜(DMSO)、甲醇(MeOH)、1.2-丙(二)醇(PG)和(二)甲(基)酰胺(DMF)作為四種抗凍劑，開(kāi)展了中華絨螯蟹不同發(fā)育時(shí)期（細(xì)胞分裂期、囊胚期、原腸期、前無(wú)節(jié)幼體期和原溞狀幼體期）在10％、15

5、％和20％的四種抗凍劑中處理30min后胚胎的成活率研究。隨抗凍劑濃度的增加，胚胎的成活率逐漸下降，細(xì)胞分裂期胚胎對(duì)抗凍劑非常敏感，胚胎分別在10％的四種抗凍劑中處理后的成活率都低于20％，顯著低于對(duì)照組成活率。四種抗凍劑對(duì)胚胎表現(xiàn)出不同的毒性，其中DMSO對(duì)胚胎毒性最高，PG毒性最低;囊胚期胚胎對(duì)濃度為20％的抗凍劑較為敏感，胚胎在20％的MeOH和20％的DMSO中處理后都不能成活;原腸期胚胎分別在10％的四種抗凍劑中處理后，胚胎的

6、成活率都低于50％，顯著低于對(duì)照組成活率(70.6±6.8％）（P＜0.05）。胚胎在20％的四種抗凍劑中處理后都能獲得成活;前無(wú)節(jié)幼體期胚胎分別在10％的四種抗凍劑中處理后，胚胎的成活率接近60％，但仍顯著低于對(duì)照組胚胎成活率(83.9±8.1％)(P＜0.05)，胚胎分別在10％的四種抗凍劑處理后，相互間成活率沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05);原溞狀幼體期胚胎對(duì)抗凍劑表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，胚胎在10％的四種抗凍劑中處理30min后,胚胎

7、的成活率與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.玻璃化液對(duì)中華絨螯蟹胚胎成活率的影響
　　在前期研究的基礎(chǔ)上,篩選了6種玻璃化液配方(A、B、C、D、E、F)，開(kāi)展了中華絨螯蟹5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期胚胎在6種玻璃化液中分別按照二步法、三步法和五步法中平衡40min后成活率的研究。細(xì)胞分裂期胚胎經(jīng)過(guò)二步平衡后在6種玻璃化液中都不能成活，在“D”號(hào)玻璃化液中經(jīng)過(guò)了五步平衡后胚胎獲得了最高的成活率，平均成活率為9.7±1.7％

8、，但顯著低于對(duì)照組成活率（45.4±4.5％）（P＜0.05);囊胚期胚胎經(jīng)過(guò)二步平衡后在6種玻璃化液中也不能成活，在A號(hào)玻璃化液中經(jīng)過(guò)五步法平衡處理后，獲得了最高的成活率，平均成活率為12.8±3.4％;原腸期胚胎在B號(hào)和F號(hào)玻璃化液中經(jīng)過(guò)二步平衡后不能成活，在A號(hào)、D號(hào)和E號(hào)玻璃化液中采用五步平衡法后都能獲得約40％的成活率，但仍顯著低于對(duì)照組成活率(70.6±6.8％)(P＜0.05);前無(wú)幼體期胚胎經(jīng)過(guò)兩步法處理后在6種玻璃化液

9、中都能獲得成活，胚胎在A號(hào)玻璃化液中采用三種不同的平衡方法處理后獲得的成活率高于在其它幾種玻璃化液中處理后的成活率;原溞狀幼體期胚胎對(duì)玻璃化液表現(xiàn)出很高的耐受性,胚胎在A號(hào)玻璃化液中經(jīng)過(guò)五步平衡后獲得了最高的成活率(63.95±3.46％）
　　4.中華絨螯蟹胚胎的玻璃化冷凍保存
　　開(kāi)展了中華絨螯蟹4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期胚胎對(duì)A號(hào)玻璃化液的耐受性和玻璃化冷凍保存方法的研究,中華絨螯蟹各個(gè)時(shí)期的胚胎在A號(hào)玻璃化液中隨著平衡時(shí)間的延

10、長(zhǎng)，其成活率逐漸下降，前無(wú)節(jié)幼體期和原溞狀幼體期胚胎在玻璃化液中的適應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)(40-60min)。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，不同時(shí)期的胚胎對(duì)玻璃化液的適應(yīng)能力不同，細(xì)胞分裂期胚胎對(duì)玻璃化液的適應(yīng)能力最低(20-30 min)，至原溞狀幼體期時(shí)適應(yīng)能力最強(qiáng)。中華絨螯蟹前無(wú)節(jié)幼體期胚胎在A號(hào)玻璃化液中平衡40 min,0.25mol/L的蔗糖分別洗脫5、10、15、20 min后，胚胎成活率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，但洗脫10min時(shí)胚胎的成

11、活率最高。前無(wú)節(jié)幼體期胚胎在A號(hào)玻璃化液中平衡40 min,在-196℃冷凍40min，快速解凍后用0.25mol/L的蔗糖洗脫10 min,有8個(gè)胚胎成活，成活率為9.3±2.5％，胚胎培養(yǎng)至第4天死亡，原溞狀幼體期胚胎在A號(hào)玻璃化液中平衡40min,在-196℃冷凍1h，經(jīng)相同濃度的蔗糖洗脫相同的時(shí)間，有7個(gè)胚胎成活，成活率11.3±3.6％,培養(yǎng)至第6天時(shí),個(gè)孵化出膜。
　　5.玻璃化冷凍對(duì)中華絨螯蟹胚胎中三種酶活性的影響<

12、br>　　運(yùn)用試劑盒分別研究了中華絨螯蟹5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的胚胎經(jīng)過(guò)6種玻璃化液處理和冷凍后胚胎中乳酸脫氫酶(LDH)、總?cè)姿嵯佘彰?Total ATPase)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)的活性變化。玻璃化液處理不同程度地降低了不同發(fā)育時(shí)期胚胎中三種酶的活性，不同的抗凍劑對(duì)同一發(fā)育時(shí)期的胚胎酶活性有不同的影響，相同的抗凍劑對(duì)不同的發(fā)育時(shí)期胚胎三種酶活性也有不同的影響,隨胚胎發(fā)育的成熟，胚胎對(duì)玻璃化液的耐受性逐漸增強(qiáng)，酶活性下降的幅度也逐漸減

13、小,原溞狀幼體期胚胎在6種玻璃化液中處理后MDH酶活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。經(jīng)過(guò)玻璃化冷凍保存后，不同時(shí)期胚胎中的酶活性與對(duì)照組和各處理組相比均顯著下降，在胚胎發(fā)育的早期，酶活性都呈現(xiàn)出急劇下降的趨勢(shì)，晚期胚胎酶活性下降的幅度則有所減緩，與不同時(shí)期各處理組中胚胎酶活性相比，玻璃化冷凍對(duì)各時(shí)期胚胎中LDH活性的影響低于總ATPase和MDH。
　　6.玻璃化冷凍對(duì)中華絨螯蟹胚胎外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響
　　運(yùn)用石

14、蠟切片技術(shù)、掃描電鏡和透射電鏡等觀察了中華絨螯蟹不同發(fā)育時(shí)期的胚胎經(jīng)過(guò)玻璃化液處理和冷凍后外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化,細(xì)胞分裂期胚胎存玻璃化液中經(jīng)過(guò)二步平衡法處理后吸水膨大明顯，三步平衡后胚胎外形與對(duì)照無(wú)明顯區(qū)別，經(jīng)過(guò)超低溫冷凍后，部分卵黃物質(zhì)從細(xì)胞中溢出，細(xì)胞破損嚴(yán)重原腸期和原溞狀幼體期胚胎在玻璃化液中經(jīng)過(guò)(三)步平衡法處理后,胚胎外部形態(tài)與對(duì)照無(wú)明顯變化。掃描電鏡觀察，經(jīng)玻璃化液處理后的原腸期胚胎表皮起皺成溝壑狀，形成一層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);透

15、射電鏡觀察，處理后胚胎細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)白色團(tuán)塊,細(xì)胞邊緣變得粗糙有突起。經(jīng)過(guò)冷凍保存后,胚體顏色變?yōu)榉奂t色，胚胎由原來(lái)的透明變成不透明狀，細(xì)胞膜邊緣模糊呈絨毛狀,胚體內(nèi)部分卵黃物質(zhì)碎裂成顆粒狀，細(xì)胞表面凹陷皺縮;組織切片觀察，胚胎細(xì)胞外面的膜脫落破損，胚層內(nèi)有大小不一的冰腔，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的空泡;透射電鏡下，細(xì)胞內(nèi)冰腔清晰可見(jiàn),空泡形成，部分線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解體，細(xì)胞破裂非常明顯。原溞狀幼體期胚胎經(jīng)過(guò)玻璃化液處理后，顯微攝像和掃描電鏡下觀察，胚

16、胎外部形態(tài)與對(duì)照都無(wú)明顯區(qū)別，但經(jīng)過(guò)超低溫冷凍后，部分組織呈彌散狀，部分卵黃物質(zhì)碎裂成顆粒狀,胚胎的細(xì)胞膜脫落，胚層內(nèi)出現(xiàn)很多冰腔和空泡;掃描電鏡下，部分胚胎表面皺縮凹陷，但仍有少數(shù)胚胎表皮保持光滑完整
　　7.玻璃化冷凍對(duì)中華絨螯蟹胚胎線粒體DNA的影響
　　研究了5種玻璃化液處理和冷凍對(duì)中華絨螯蟹細(xì)胞分裂期胚胎線粒體DNA的影響。經(jīng)過(guò)玻璃化液處理和冷凍后，中華絨螯蟹胚胎線粒體上的Cytb基因均能被穩(wěn)定擴(kuò)增，PCR電電泳產(chǎn)

17、物大小約1600bp，產(chǎn)物經(jīng)回收后進(jìn)行雙向測(cè)序、比對(duì)和校正,獲得10條Cytb基因全序列，長(zhǎng)度為1135bp，其中有5個(gè)核苷酸變異位點(diǎn),1135bp的Cytb基因序列一共編碼378個(gè)氨基酸殘基，從ATG第一位起始密碼子開(kāi)始到1140位終止。經(jīng)過(guò)玻璃化液處理和冷凍后，胚胎線粒體上的COI基因也能被穩(wěn)定擴(kuò)增，PCR電泳產(chǎn)物大小約1600bp，產(chǎn)物經(jīng)回收后進(jìn)行雙向測(cè)序、比對(duì)和校正，獲得10條COI基因全序列，長(zhǎng)度為1534bp，其中有6個(gè)核苷