甾類激素分析課件

1、第七節(jié),甾體激素類藥物的分析,,激 素（hormone）,激素分類含氮激素：胺類、多肽、蛋白質(zhì) 不宜口服（甲狀腺激素除外）不含氮激素（甾體激素）：性激素、腎上腺皮質(zhì)激素 可口服,2024/3/9,2,基本結(jié)構(gòu)：環(huán)戊烷駢多氫菲,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,概述,分類,甾體激素,腎上腺皮質(zhì)激素,性激素,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,雌激素,,

2、,腎上腺皮質(zhì)激素,氫化可的松,,,17,腎上腺皮質(zhì)激素,醋酸地塞米松,,,,21,9,17,雄性激素,丙酸睪酮,,,蛋白同化激素,苯丙酸諾龍,,,,孕激素,黃體酮,,,雌激素,炔雌醇,,,一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì),1. 腎上腺皮質(zhì)激素,2. 雄性激素及蛋白同化激素,3. 孕激素,4. 雌激素,二、鑒別試驗,（一）與強酸的呈色反應(yīng),甾體激素類藥物,呈色,,H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl,（母核）,(二) 官能團的

3、反應(yīng),腎上腺皮質(zhì)激素藥物,呈色,,四氮唑鹽OHˉ,1 C17 – α – 醇酮基,還原性,A. 呈色反應(yīng),腎上腺皮質(zhì)激素藥物,Cu2O↓橙紅色,,堿性酒石酸銅,B. 沉淀反應(yīng),Ag↓黑色,,氨制硝酸銀,,甾酮類激素藥物,呈色,,羰基試劑,2. C3–酮基和C20–酮基,＃常用的羰基試劑：2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼,異煙腙（黃色）,睪酮,黃體酮,異煙雙腙（黃色）,具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物,呈色,,

4、亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚芳香醛,3. 甲酮基,黃體酮,藍紫色,,亞硝基鐵 氰化鈉,其他甾體,,,淡橙色不顯色,黃體酮,藍紫色,有機氟,Fˉ,,有機破壞,有機氯,,,Clˉ,4. 有機鹵素,,茜素氟藍 硝酸亞鈰,硝酸—硝酸銀,,AgCl↓,呈色,茜素氟藍,藍紫色,,F-,雌激素類藥物,紅色偶 氮染料,,重氮苯磺酸,5. 酚羥基,含炔基的甾體激素,銀鹽沉淀,,硝酸銀,6. 乙炔基,,↓,炔雌醇,,白,,△,KOH

5、,(三) 制備衍生物測定m.p.,△,△,香,（四）水解產(chǎn)物的反應(yīng),,特臭,特臭,△４-3-酮 240nm,苯環(huán) 280nm,（五） UV法,3300～3000cm-1,3000～2700cm-1,1900～1650cm-1,1650～1450cm-1,1000～650cm-1,（六） IR法,3750～3300cm-1,ν,醋酸可的松,結(jié)構(gòu)特征：△4–3–酮、C17 –OHC20 –酮基、

6、C11 –酮基、醋酸酯,1630cm-1,ν,3420cm-,,亞甲基、角甲基吸收帶,1750cm-1,1232cm-1,1052cm-1,結(jié)構(gòu)特征：△4–3–酮、C17 –OH C17–乙炔基,炔諾酮,1650cm-1,ν,3300cm-,3270cm-1,ν,1615cm-1,結(jié)構(gòu)特征：酚羥基、C17 –OH C17 –乙炔基,炔雌醇,1505cm-1,

7、ν,3505cm-,3300cm-1,ν,1590cm-1,3610cm-,ν,酚羥基,醇羥基,1615cm-1,苯環(huán)的骨架振動,（七） TLC法,主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別,方法：對照品法 要求供試品溶液所顯主斑點的顏色和位置與對照品溶液的主斑點相同。,炔諾酮TLC圖,（八） HPLC法,主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別（如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏）,方法：對照品法 要求在含量測定項下記錄的

8、色譜圖中，供試品峰的tR與對照品峰的tR一致。,三、 雜質(zhì)檢查,（一）其他甾體,定義 與標(biāo)示藥物結(jié)構(gòu)不同的甾體化合物都稱為“其他甾體”,,Li/NH3 C2H5OH,,弱酸,雌二醇－3－甲醚,苯丙酸諾龍的合成路線,I,II,,,強酸,苯丙酰氯,HCl,III,特點 （1）可能存在多個甾體雜質(zhì) （2）結(jié)構(gòu)類似,2. 來源 原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物,4. 方法（具有一

9、定分離能力） TLC法（高低濃度對比法） HPLC法（類似高低濃度對比法）,（1）TLC法（高低濃度對比法）,判定方法： 規(guī)定雜質(zhì)斑點數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)斑點顏色,醋酸氟輕松 檢查 其他甾體,取本品加氯仿-甲醇（9 ：1）制成3.0mg/ml作為供試液，精密量取適量，加氯仿-甲醇（9 ：1）稀釋成0.06mg/ml作為對照液；照薄層色譜法，各取5μl，分別點于同一硅膠G板上，以氯仿-甲醇（97 : 3）為

10、展開劑，展開后晾干，在105℃干燥10分鐘，放冷，噴以堿性四氮唑藍試,液，立即檢視，供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點，不得多于2個，其顏色與對照液的主斑點比較，不得更深。,1,2,（1）簡便易行，不需特殊的儀器； （2）不需對照品； （3）只能控制單個雜質(zhì)的限量； （4）要求雜質(zhì)與主成分的顯色靈敏度接近。,特點,（2）HPLC法（高低濃度對比法）,判定方法： 規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)峰面積,取本品適量，精密稱定，以無水乙醇為溶劑，

11、配制成每1ml含2mg的溶液（1）與每1ml含0.04mg的溶液（2），用含量測定項下的方法和溶液(0.16mg/ml)，取10μl注入液相色譜儀，調(diào)整儀器靈敏度，使主成分峰高度達記錄儀的滿量程。再分別取溶液（1）,醋酸甲地孕酮 檢查 其他甾體,和溶液（2）各10μl，進樣。記錄至主成分峰保留時間的2倍。溶液（1）顯示的雜質(zhì)峰數(shù)不得超過4個，各雜質(zhì)峰面積及其總和分別不得大于溶液（2）主峰面積的1/2和3/4。,供試溶

12、液：溶液（1）2mg/ml,對照溶液：溶液（2）0.04mg/ml,（1）需特殊的儀器； （2）不需對照品； （3）可以控制雜質(zhì)的總量；,特點,（二）游離磷酸,地塞米松磷酸鈉氫化可的松磷酸鈉倍他米松磷酸鈉氫化潑尼松磷酸鈉,對照品法,原理：,方法：,檢查 游離磷酸,地塞米松磷酸鈉,精密稱取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加鉬酸銨硫酸試液2.5ml與1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度

13、，搖勻，在20℃放置30～50分鐘，照分光光度法，在740nm處測定吸收度，與對照液4.0ml同法處理的吸收度比較，不得更大。,（對照液 0.0035%KH2PO4）,（三）甲醇和丙酮,（靈敏度法）,甲醇 不得出峰 檢測限= 3.1ng,丙酮 ≤5.0% 內(nèi)標(biāo)法 + 校正因子,GC法,地塞米松磷酸鈉,檢查 甲醇和丙酮,精密稱取本品0.16g，置10ml量瓶中，精密

14、加內(nèi)標(biāo)溶液2ml，加水稀釋至刻度，作為供試液；另精密量取甲醇10μl(≈7.9mg)與丙酮100μl(≈79mg)置100ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液20ml，加水至刻度，作為對照液。照氣相色譜法測定，含丙酮不得過5.0%，并不得出現(xiàn)甲醇峰。,炔雌醇,硒,(四)、,來源 合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫,劇毒,,原理,,方法,醋酸氟輕松 檢查 硒 取本品50mg，照氧瓶燃燒法進行破壞后，

15、將吸收液轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用水15ml沖洗燃燒瓶及鉑絲，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒對照液（0.05ug/ml）和上述供試品溶液分別用氨試液調(diào)節(jié)pH值至2.0 0.2后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水,少量分次洗滌燒杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加鹽酸羥胺溶液（1→2）1ml，搖勻后，立即精密加二氨基萘試液5ml，搖勻，在室溫下放置100分鐘，精密加環(huán)己烷5ml，強烈振搖2′，靜置分層，取環(huán)己烷脫水后，測A378nm。

16、 規(guī)定 A供＜A對。,四、含量測定,（一）UV法,△４-3-酮 240nm（±）,腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素,苯環(huán) 280nm（±）,雌激素,,（二）反應(yīng)分光光度法,1. 適用于非分光光度活性藥物2. 使待測組分光譜位移，避免干擾3. 增加測定靈敏度4. 增加選擇性,弱、非分光光度活性藥物,,強分光光度活性藥物,化學(xué)反應(yīng),腎上腺皮質(zhì)激素類,C17 -α－醇酮基

17、,強還原性,1. 原理,四氮唑比色法,[O],,OH-,分子重排,三苯甲瓚↓深紅,,,藍四氮唑（BT）,,,雙甲瓚（暗藍）,2. 方法,ChP TTC（RT） BP TTC（RT）USP BT,對照品法,醋酸潑尼松龍軟膏 含量測定對照液：精密稱取醋酸潑尼松龍對照品20mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。供試液：精密稱取本品4g（約相當(dāng)于醋

18、酸潑尼松龍20mg），置燒杯中，加無水乙醇約30ml，置水浴上加熱，充分?jǐn)嚢瑁勾姿釢娔崴升埲芙?，再置冰浴中冷卻，濾過，濾液置100ml量瓶中，同法提取,三次，濾液并入量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法：精密量取上述溶液各1ml，分別置干燥具塞試管中，各精密加無水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液2ml，搖勻，再各精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25℃暗處放置40～50分鐘，照分光光度法，在485

19、nm的波長處分別測定吸收度，計算，即得。操作應(yīng)避光。,,,,,,,3. 討論,（1） 基團對反應(yīng)速度的影響,C11= O＞ C11－OH,C21－OH＞ C21-酯,C16無論何種取代基ν↓,（2） 溶劑、水分的影響,含水量＞5%→ν↓,含水10%→A↓10%含水30%→幾無反應(yīng),,— 無水乙醇,（3） O2與光線的影響,反應(yīng)過程反應(yīng)產(chǎn)物,怕光,→避光、快速,,O2影響顏色強度和穩(wěn)定性,→隔絕空氣、 快速、充N2,（4）

20、堿的種類及加入順序,反應(yīng)應(yīng)在強堿性（pH13.75）條件下進行以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳,加入順序：,（5） 溫度與時間,t℃↑→ν↑→甲瓚分解↑→%↓,4. 特點： 缺點 影響因素太多 優(yōu)點 測定結(jié)果能指示藥品 的穩(wěn)定性（氧化及降解產(chǎn)物無此反應(yīng)）,腎上腺皮質(zhì)激素、 雄性激素和蛋白同化激素、孕激素,C3－酮基,1. 原理,異煙腙（黃色）,2. 方法

21、,暗45′,對照品法,醋酸地塞米松軟膏 含量測定對照液：精密稱取醋酸地塞米松對照品25mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取5ml，用無水乙醇稀釋至50ml，搖勻。供試液：精密稱取本品適量（約相當(dāng)于醋酸地塞米松25mg），置燒杯中，加無水乙醇約25ml，置水浴中加熱，攪拌，使醋酸地塞米松溶解，再置冰浴中冷卻，,,,,,濾過，濾液置100ml量瓶中，同法提取三次，濾液并入量瓶中，用無

22、水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法：精密量取上述溶液各10ml，分別置具塞容器中，置水浴中蒸去乙醇，殘渣中加氯仿10ml，振搖，使殘渣溶解，各精密加0.1%異煙肼甲醇溶液10ml，搖勻，置55℃暗處保溫45分鐘，取出，放冷，用氯仿稀釋至25ml。搖勻，在415nm的波長處分別測定吸收度，計算即得。,,,,,3.討論,反應(yīng)速度,（1）,C3= O ＞ C17= O 、 C20= O C11

23、= O 不反應(yīng),反應(yīng)專屬性 C3－酮基,（2）溶劑的選擇,異煙肼鹽酸鹽→甲醇、乙醇,無水甲醇無水乙醇,,（3）水分、O2與光線的影響,含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓,不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時→ O2與光線無影響,酸、異煙肼的量,(3),鹽酸 : 異煙肼 = 2 : 1,樣品 : 異煙肼 = 1 : 8 →ν↑,t℃ ↑ → ν↑,1. 原理,雌激素,,雌二醇-3-甲醚

24、,,λmax=465,λmax=515,,,,USP、BP、JP均采用,RP－HPLC（大多內(nèi)標(biāo)法）,特點 用樣量少，靈敏度高，分離效 果好，測定速度快,（甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對利用結(jié)構(gòu)特征設(shè)計的比色法有干擾）,1，甾體激素類藥物的結(jié)構(gòu)中能和四氮唑鹽發(fā)生顯色反應(yīng)的基團。 A. 酚羥基 B. 活潑次甲基 C.

25、 甲酮基 D. C17 -α-醇酮基 E. 酮基,,2，用異煙肼比色法測定甾體激素藥物含量時，其溶液的環(huán)境是 A．強酸性 B．中性 C．強堿性 D．弱堿性 E．以上都不對,,問題3 A．維生素B1 B．醋酸地塞米松 C．兩者皆是 D．兩者皆不是 31. 異

26、煙肼比色法 32. 硫色素反應(yīng) 33. 紫外分光光度法 34. 羥肟酸鐵反應(yīng) 35. 綠奎寧（Thaciaquin）反應(yīng),B,A,C,D,D,4，可用于氫化可的松鑒別的試劑有 A．氨制硝酸銀 B．異煙肼 C．紅四氮唑 D．硫酸 E．重氮苯磺酸,,,,,5．可用于甾體激體類藥物的測定

27、方法有 A．高效液相色譜法 B．四氮唑鹽法 C．紫外分光光度法 D．異煙肼比色法 E．Kober反應(yīng)比色法,,,,,,6，能與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)生成蘭紫色的藥物是 A．雌二醇 B．黃體酮 C．醋酸可的松 D．苯丙酸諾龍 E

28、．以上都不對,,A. 它們沒有特征紫外吸收，不能用紫外分光光度法。 B. 不能用滴定分析法進行測定。 C. 由于“其它甾體”的存在，色譜法可消除它們的干擾。 D. 色譜法比較簡單，精密度好。 E. 色譜法準(zhǔn)確度優(yōu)于滴定分析法。,,7. 各國藥典對甾體激素類藥物常用HPLC或GC法測定其含量，主要原因是。,8．異煙肼比色法測定甾體激素類藥物時，藥物的呈色基團是 A. 酮基

29、 B. 酚羥基 C. 活潑次甲基 D. 炔基 E. 甾體母核,,9. 四氮唑比色法可用于下列哪個藥物的含量測定 A. 可的松 B. 睪丸素 C. 雌二醇 D. 炔雌醇

30、 E. 黃體酮,,10，可適用的藥物： A. 可的松 B. 雌二醇 C. 兩者均可 D. 兩者均不可 116．亞硝酸鈉滴定法 117．高效液相色譜法 118．能與羰基試劑縮合 119．可用kober反應(yīng)比色法測定 120．可用四氮唑比色法測定,D,C,A,B,A,11．Kober反應(yīng)是 A. 雌性激素與硫酸乙醇共熱呈色

31、 B. 皮質(zhì)激素與硫酸一乙醇共熱呈色 C. 雌性激素與硫酸－乙醇共熱呈色，用水或稀硫酸稀釋后加熱顏色改變 D. 維生素A與無水三氯化銻的無醇氯仿溶液呈色 E. 異丙嗪于酸性條件下與鈀離子呈色,,12. 黃體酮在酸性溶液中可與下列哪些試劑反應(yīng)呈色 A. 2,4-二硝基苯肼 B. 三氯化鐵 C. 硫

32、酸苯肼 D. 異煙肼 E. 四氮唑鹽,,,,13. Kober反應(yīng)適用于哪一藥物的含量測定 A. 黃體酮 B. 雌二醇 C. 甲基睪丸素 D. 甲基炔諾酮 E. 氫化可的

33、松,,14，用四氮唑比色法測定皮質(zhì)激素類藥物，是利用C17 –α醇酮基的何種性質(zhì) A．氧化性 B．還原性 C．可加成性 D．酸性 E．堿性,,15，可與重氮苯磺酸作用生成紅色偶氮染料的甾體激素類藥物是。 A. 醋酸可的松 B. 睪酮 C. 黃體酮 D. 雌二醇