鎘誘發(fā)氧化應(yīng)激相關(guān)毒性效應(yīng)與機(jī)理的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、鎘是一種典型的重金屬污染物,主要通過化石燃料燃燒、磷肥、自然來源、鋼鐵鑄造、生活垃圾焚燒、水泥及有色金屬生產(chǎn)和其他工業(yè)生產(chǎn)等途徑進(jìn)入環(huán)境。隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展,環(huán)境中鎘污染的問題已廣泛存在于全球的大部分區(qū)域,且人體接觸鎘暴露的機(jī)會呈逐年上升的趨勢。由于鎘在環(huán)境中的普遍存在和其潛在的毒性效應(yīng),目前鎘污染帶來的環(huán)境問題和對人體健康的毒性效應(yīng)引起了廣泛的關(guān)注和研究。
  鎘是生物體內(nèi)的一種非必需元素,不可以被機(jī)體降解。對于非職業(yè)暴露人

2、群,鎘主要通過被污染的食物和吸煙進(jìn)入其體內(nèi)。鎘進(jìn)入人體后,經(jīng)血液循環(huán)系統(tǒng)分布到全身各器官,引發(fā)骨、肝、腎和生殖系統(tǒng)等多系統(tǒng)性、多器官性的機(jī)體損傷。研究表明重金屬在機(jī)體內(nèi)誘發(fā)的氧化應(yīng)激與多種疾病相關(guān)。鎘可以在體內(nèi)和體外通過擾亂氧化還原平衡進(jìn)而誘發(fā)氧化應(yīng)激。鎘誘發(fā)活性氧物質(zhì)(ROS)的大量積累會造成機(jī)體內(nèi)的一系列非特異性損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡乃至組織損傷,被認(rèn)為是疾病的一般機(jī)制。
  目前,鎘暴露誘發(fā)的氧化應(yīng)激相關(guān)毒性效應(yīng)與作用機(jī)理尚未完

3、全闡明,相關(guān)研究的方法學(xué)還需要進(jìn)一步建立和完善。取決于實(shí)驗(yàn)條件和研究對象的不同,鎘誘發(fā)的氧化應(yīng)激相關(guān)毒性效應(yīng)與作用機(jī)理仍存在爭議。針對以上問題,本研究從動物、細(xì)胞和分子水平上研究了鎘誘發(fā)氧化應(yīng)激相關(guān)毒性效應(yīng)與機(jī)理,主要包括以下六個(gè)部分:
  第一章簡要介紹了環(huán)境中鎘污染的特點(diǎn)和現(xiàn)狀以及鎘毒性效應(yīng)的研究進(jìn)展,概述了氧化應(yīng)激、氧化損傷及其調(diào)控和作用機(jī)制,歸納了鎘暴露誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激相關(guān)毒性效應(yīng)與機(jī)理。通過文獻(xiàn)綜述,總結(jié)了本領(lǐng)域的研究

4、進(jìn)展和目前存在的尚待解決的科學(xué)問題,并針對這些問題設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)方案。
  第二章以斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)對象,從實(shí)驗(yàn)動物層面上通過檢測了鎘誘發(fā)斑馬魚肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激過程中生物標(biāo)記物的變化,包括抗氧化酶過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的活力變化,還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量變化,研究了鎘

5、染毒誘發(fā)斑馬魚肝臟內(nèi)的氧化應(yīng)激相關(guān)毒性效應(yīng)與機(jī)理。研究結(jié)果表明鎘暴露導(dǎo)致GPx酶活力上升,GR和GST酶活力下降;直接抗氧化酶CAT酶活力下降,而SOD酶活力上升;GSH含量下降而GSSG含量上升,GSH/GSSG比率下降;以及MDA含量升高。這些研究結(jié)果表明鎘暴露誘發(fā)斑馬魚肝臟內(nèi)產(chǎn)生了大量的ROS,打破了氧化還原平衡態(tài),誘發(fā)了氧化應(yīng)激,對斑馬魚肝臟造成了氧化損傷。
  第三章以小鼠原代肝細(xì)胞為研究對象,經(jīng)體外染毒,從細(xì)胞水平研究

6、鎘在小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)的氧化應(yīng)激相關(guān)毒性效應(yīng)與機(jī)理。細(xì)胞經(jīng)6或24小時(shí)鎘暴露后,原位測定了細(xì)胞內(nèi)的Cd2+含量,并測定了細(xì)胞活力、凋亡情況,胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK信號通路和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的活化情況,氧化應(yīng)激相關(guān)的生物標(biāo)記物ROS,GSH,CAT和SOD的變化,DNA損傷及組蛋白磷酸化的情況。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)6h鎘暴露后,細(xì)胞內(nèi)無游離的Cd2+存在且鎘對細(xì)胞沒有明顯的毒性。而經(jīng)過24 h鎘暴露后,部分細(xì)

7、胞內(nèi)發(fā)生了ROS含量持續(xù)升高等氧化應(yīng)激效應(yīng)、凋亡比例升高以及DNA氧化損傷等毒性效應(yīng)。采用抗氧化劑N-乙?;?L-半胱氨酸(NAC)對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵育可以阻止鎘暴露造成的肝細(xì)胞活力的下降、凋亡比例的升高以及DNA損傷。上述結(jié)果說明鎘在肝細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)了氧化應(yīng)激并對肝細(xì)胞產(chǎn)生了毒性效應(yīng)。鎘通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡降低了肝細(xì)胞活力。鎘暴露后肝細(xì)胞內(nèi)ERK通路被激活,NAC可以降低ERK通路的活化程度; NAC和ERK信號通路的抑制劑PD98059降

8、低了細(xì)胞凋亡比例和caspase-3的活化程度。上述結(jié)果說明氧化應(yīng)激調(diào)控的下游ERK信號通路的活化參與了鎘引起的小鼠原代肝細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)并證明了鎘引起組蛋白H3的磷酸化與氧化應(yīng)激和ERK通路的活化緊密相關(guān)。
  第四章以抗氧化酶CAT和SOD為研究對象,采用熒光光譜法、紫外-吸收光譜以及圓二色譜等多種光譜法研究了鎘對蛋白結(jié)構(gòu)的影響;采用酶活性檢測的方法測定了鎘暴露后酶活性的變化;采用等溫量熱滴定法(ITC)研究了鎘與兩種酶

9、的結(jié)合模式,計(jì)算了結(jié)合參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù);采用分子模擬等技術(shù)模擬了蛋白上鎘的結(jié)合位點(diǎn),建立兩者的作用模型,并結(jié)合前述實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論,解釋蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化的機(jī)理。
  (1)鎘與CAT分子的直接相互作用導(dǎo)致CAT酶活性下降。鎘與CAT主要通過靜電作用力結(jié)合,與CAT有一類結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合常數(shù)K=(2.69±0.243)×103 Mq。鎘靜態(tài)猝滅了CAT的內(nèi)源熒光,兩者形成了復(fù)合物,改變了芳香環(huán)氨基酸殘基微環(huán)境的疏水性。兩者的結(jié)合改變了

10、CAT的二級結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶分子發(fā)生錯(cuò)折疊現(xiàn)象。對接的結(jié)果表明鎘與底物進(jìn)入CAT活性中心通道上的Gln167和Trp185相互作用,阻止底物進(jìn)入酶活性中心,導(dǎo)致CAT的酶活性下降。
  (2)鎘與SOD分子的直接相互作用導(dǎo)致SOD酶活性上升。鎘與SOD主要通過靜電作用力結(jié)合,與SOD有兩類結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合常數(shù)分別為K1=(6.07±1.47)×105 M-1和K2=(1.02±0.132)×104 M-1。鎘暴露改變了SOD的二級結(jié)構(gòu),

11、導(dǎo)致酶分子發(fā)生去折疊現(xiàn)象。并且,鎘不優(yōu)先與SOD的發(fā)色團(tuán)氨基酸殘基發(fā)生作用,而是在SOD構(gòu)象發(fā)生變化發(fā)色團(tuán)外露后才與發(fā)色團(tuán)發(fā)生作用。分子對接的結(jié)果表明鎘結(jié)合到了SOD兩亞基的交界面,可能造成酶活性位點(diǎn)附近的口袋增大,進(jìn)而導(dǎo)致酶活性上升。
  第五章以具有間接抗氧化作用的蛋白溶菌酶(LYZ)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)為研究對象,采用熒光光譜法、紫外-吸收光譜以及圓二色譜等多種光譜法研究了鎘對蛋白結(jié)構(gòu)的影響;采用酶活性檢測的方法測定了鎘暴露后

12、酶活性的變化;采用ITC研究了鎘與蛋白相互作用過程中的結(jié)合模式,計(jì)算了結(jié)合參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù);采用分子模擬等技術(shù)模擬了蛋白上鎘的結(jié)合位點(diǎn),建立兩者的作用模型,并結(jié)合前述實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論,解釋蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化的機(jī)理。
  (1)鎘主要通過疏水作用力與LYZ相互作用,改變了LYZ的二級結(jié)構(gòu)。盡管兩者形成了復(fù)合物,但在低濃度鎘暴露時(shí),鎘不優(yōu)先結(jié)合于LYZ的活性位點(diǎn)附近,所以LYZ活性無變化。而在相對高濃度鎘暴露時(shí),鎘與LYZ活性位點(diǎn)的關(guān)鍵

13、氨基酸殘基Glu35和Asp52發(fā)生作用,導(dǎo)致酶活性受到抑制。
  (2)TF可以結(jié)合鎘并且中和鎘對肝細(xì)胞的毒性。鎘靜態(tài)猝滅了TF的內(nèi)源熒光,與TF分子形成復(fù)合物,使TF發(fā)生α螺旋含量降低和蛋白質(zhì)皺縮等結(jié)構(gòu)和構(gòu)象上的變化。鎘主要通過疏水作用力優(yōu)先與TF上結(jié)合力高的位點(diǎn)結(jié)合,對TF的鐵結(jié)合位點(diǎn)沒有影響且不會造成鐵的釋放。高結(jié)合力位點(diǎn)飽和后,鎘主要通過靜電作用力結(jié)合到TF上結(jié)合力較弱的位點(diǎn),與鐵結(jié)合位點(diǎn)周圍的Tyr517和Tyr95相

14、互作用,造成鐵的釋放。
  第六章對本論文的工作進(jìn)行了總結(jié),歸納了了本研究中的創(chuàng)新點(diǎn),分析了研究方法的不足,并展望了該領(lǐng)域的發(fā)展方向和下一步的研究計(jì)劃。本研究結(jié)合體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞及分子實(shí)驗(yàn)三種毒性評價(jià)的方法,評價(jià)了鎘在肝臟及肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激相關(guān)毒性效應(yīng),研究了鎘致肝細(xì)胞發(fā)生凋亡、遺傳和表觀遺傳毒性的作用機(jī)理,建立了鎘與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白間的作用模型并完善了污染物造成蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化及其作用機(jī)制的研究方法。三種暴露途徑聯(lián)

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