李園殺菌劑生物化學資料資料

1、殺菌劑生物化學-部分內容,李 園010-62815940liyuancaas@126.com,中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,2013-10-30,,病原菌對殺菌劑的抗性機理,2,,殺菌劑的作用機理,,殺菌劑混配增效和拮抗機理,,殺菌劑選擇性作用生化機制,4,,殺菌劑在環(huán)境或生物體內代謝,課程內容,第三章 殺菌劑混配增效和拮抗機理,一 、化學作用 二、 混劑中的藥物與目標生物生理生化過程的相互作用（一）增效作用1 不依賴載體

2、的通透原生質膜的擴散作用： 2 依賴載體介質的運轉而通透原生質膜 3 向作用位點的轉移 4 活化作用（二）拮抗作用 復配混劑對同一種生物的毒力比組成混劑的各藥劑單用毒力之和顯著低時，稱為拮抗作用。拮抗作用表現(xiàn)在防治效果降低，對保護對象表現(xiàn)藥害減輕。,,例如：多氧霉素和滅瘟素混用，降低多氧霉素對水稻紋枯病的防治效果。拮抗作用在降低對被保護對象的藥害方面也有很多例子，如硫酸鋅和代森錳混用，可降低代森錳的藥害。銅制劑和鏈

3、霉素混用，減輕鏈霉素對白菜的藥害。利用這些拮抗作用，可以擴大藥劑的應用范圍。拮抗機理：1、對酶的競爭作用2、補償作用,將欲混配的兩種單劑按田間推薦使用劑量進行混配，并計算出兩種單劑的質量比。測定混配后的藥液對黃瓜白粉病的防治效果，根據(jù)公式計算出不同藥劑混配后增效系數(shù)，篩選具有增效作用的配比。,,,,第四章 殺菌劑選擇性作用生化機制,選擇性作用類型：真菌與植物間；不同病害/不同菌系間；對菌類不同反應間；類似化合物的不同

4、結構之間；不同藥劑間；藥劑的不同作用點之間的選擇性。,一、內吸殺菌劑在病菌和植物之間的選擇性1、藥劑作用點或接受點之間的不同2、藥劑作用于細胞結構的化學組分不同3、藥劑對生物合成的干擾在病菌和植物的影響不同4、藥劑所影響的酶類在含量上或活性上在菌類和植物中有很大的不同 5、抑制病菌的致病力或降低其毒力的藥劑對植物生長完全沒有影響 6、植物抗病誘導劑,二、內吸殺菌劑對不同菌之間的選擇性1、病菌體內藥劑接受點或藥劑作用系統(tǒng)

5、的不同萎銹靈對擔子菌：呼吸鏈上復合物Ⅱ處的電子傳遞，QPs蛋白質子囊菌或霜霉菌：復合物Ⅱ處缺乏QPs蛋白質，因而對該藥不敏感。2、藥劑吸收量的不同或藥劑在細胞內累積量的不同在非內吸殺菌劑中較為明顯3、鈍化和強化藥物能力的不同 4、藥劑作用系統(tǒng)或作用點在不同菌體中對生命力影響程度不同,（一）、保護性殺菌劑1、無機銅殺菌劑防治小麥腥黑穗病、葡萄霜霉病等多種作物病害。代表藥劑：波爾多液、硫酸銅、氫氧化銅、氧化亞銅等。作

6、用機制：殺菌、抑菌效果歸因于銅離子。表現(xiàn)為：1）與菌體細胞膜上含巰基的酶作用，使酶失去活性。2）與細胞膜表面的鈣、鎂、鉀等陽離子交換，影響菌體細胞膜蛋白質的活性。3）局部深入菌體內與某些酶結合，影響其活性。,2、無機硫殺菌劑石硫合劑防治白粉病代表藥劑：石硫合劑、硫磺、膠體硫作用機制：對靶標菌的毒力作用主要歸因于硫離子和少量硫化氫氣體對病原菌的殺菌和抑菌效果，是菌體細胞的呼吸抑制劑，作用于：1）病原菌細胞色素b和c之間的氧

7、化還原體系之間的電子傳遞過程；2）阻礙菌體內三羧酸循環(huán)中的琥珀酸的氧化。,3、有機硫殺菌劑防治果樹、蔬菜霜霉病、白粉病、炭疽病等。代表藥劑：“福美”類、“代森”類等二硫代氨基甲酸衍生物“福美”類作用機制：抑制一些酶的活性，干擾三羧酸循環(huán)。在菌體內代謝為含硫氰基（-N=C=S）的化合物，硫氰基使病原菌細胞體內氨基酸和酶的巰基失活，最終抑制這些物質的合成和功能?！按鳖愖饔脵C制：表現(xiàn)為1）破壞了輔酶A，直接影響了需要有輔酶A參

8、與的脂肪酸的β氧化，丙酮酸脫氫酶系、α-酮戊二酸脫氫酶系的活性；2）抑制以銅、鐵為輔基的酶的活性。,4、取代苯類殺菌劑對立枯絲核菌有特效，對甘藍根腫病菌、白絹病菌、馬鈴薯瘡痂病菌、油菜菌核病菌、放線菌均有防效。對腐霉菌、疫霉菌、鐮刀菌、輪枝菌等土傳病菌防效差。代表藥劑：五氯硝基苯、百菌清作用機制：五氯硝基苯影響菌體細胞有絲分裂。百菌清能與真菌細胞中的3-磷酸甘油醛脫氫酶發(fā)生作用，與該酶體中含有半胱氨酸的蛋白質結合，破壞酶的活力，

9、使真菌細胞的呼吸代謝受到破壞而喪失生命力。,5、酰亞胺類殺菌劑對灰霉孢屬、核盤菌屬、葡萄孢屬、鏈格孢屬、絲核菌屬真菌有特效。代表藥劑：異菌脲、腐霉利、乙菌利、乙烯菌核利作用機制：這類藥劑能夠抑制含有-NH2和-SH的重要物質，如氨基酸和酶的合成，對細胞膜和細胞壁也有影響，改變膜的滲透性和功能。此外，異菌脲也能抑制蛋白激酶，控制一些細胞內的信號傳遞。,腐霉利（procymidone）,乙烯菌核利（vinclozolin）,異菌脲（i

10、prodione）,（二）、內吸性殺菌劑1、羧酰替苯胺類防治大麥及小麥的散黑穗和銹病。代表藥劑：萎銹靈、氧化萎銹靈、拌種靈、麥銹靈作用機制：該類殺菌劑為呼吸抑制劑?？稍谡婢毎杏羞x擇性地積累，最終抑制線粒體呼吸中重要的琥珀酸脫氫酶的活性。對孢子萌發(fā)不產(chǎn)生完全抑制作用，而是延緩了孢子萌發(fā)的時間，抑制芽管的伸長。,2、苯并咪唑類對大多數(shù)子囊菌、半知菌、擔子菌引起的病害有特效，但對半知菌中的交鏈孢、長蠕孢、輪枝孢引起的病害效果

11、差，對細菌和卵菌無效。代表藥劑：多菌靈、苯菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈作用機制：苯并咪唑類作用方式與秋水仙素十分相似，在病原物細胞分裂過程中，藥劑可與紡錘絲的β-微管蛋白相結合，干擾細胞核有絲分裂，導致真菌細胞內染色體加倍。作用位點單一，選擇性較強，病原菌易產(chǎn)生抗藥性。,3、有機磷類防治稻瘟病，對水稻菌核病、紋枯病、玉米大小斑病也有效，對絲核菌、灰霉菌、核盤菌、青霉菌、霜霉病菌、疫霉菌、白粉菌效果好。代表藥劑：稻瘟凈、甲基立枯磷

12、、乙膦鋁、三乙膦酸鋁作用機制：稻瘟凈主要通過影響細胞膜上的卵磷脂合成過程的甲基轉移酶的活性，表現(xiàn)為對細胞壁合成的影響。甲基立枯磷殺菌作用機制是抑制DNA、RNA、蛋白質的生物合成及氧的吸收。三乙膦酸鋁對靶標病原菌除直接的抑菌作用外，還可能通過誘導寄主植物體內產(chǎn)生酚類、倍半萜類物質，增強寄主抗病能力。,4、酰苯胺類對卵菌中腐霉屬、疫霉屬、霜霉病菌有特效。代表藥劑：苯霜靈、甲霜靈、呋霜靈、甲呋酰胺等。作用機制：抑制rRNA

13、聚合酶的活性，從而抑制了rRNA的生物合成。表現(xiàn)出菌體細胞壁加厚，影響病原菌侵入后菌絲在寄主植物體內的發(fā)育，對孢子囊的萌發(fā)沒有影響。,5、三唑類對各種銹病、白粉病、麥類根腐病、黑穗病、葉枯病、全蝕病效果好，對子囊菌、擔子菌、半知菌均有一定效果，對卵菌無活性。代表藥劑：三唑酮、三唑醇、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑、丙環(huán)唑、乙環(huán)唑、戊唑醇等。作用機制：三唑類化合物的含氮雜環(huán)部分的氮與細胞色素P-450的鐵離子結合，抑制麥角甾醇的生物合成，破

14、壞菌體細胞膜功能。三唑類化合物影響了植物中赤霉素的合成，具有植物生長調節(jié)劑的作用。,6、甲氧基丙烯酸酯類對小麥葉枯病、網(wǎng)斑病、云紋病、白粉病等效果顯著。代表藥劑：嘧菌酯、唑菌胺酯、醚菌酯、肟醚菌胺、苯醚菌酯等。作用機制：甲氧基丙烯酸酯類為線粒體呼吸抑制劑，藥劑與線粒體電子傳遞鏈中復合物III（Cytbc1復合物）結合，阻斷電子從Cytbc1復合物流向Cytc，阻止ATP合成，干擾真菌細胞的呼吸作用，破壞能量形成，從而抑制靶標病

15、原菌生長或殺死病原菌。,7、羧酸氨基化合物類殺菌劑對多數(shù)卵菌植物病原菌，如霜霉屬、疫霉屬病菌效果顯著。代表藥劑：烯酰嗎啉、氟嗎啉、異丙菌胺、雙炔酰菌胺等。作用機制：尚未明確。研究表明，該類殺菌劑對游動孢子的釋放和游動沒有抑制作用，對細胞壁的所有階段均具有明顯的抑制作用，推測可能影響細胞壁物質的合成。,（三）植物誘導抗病激活劑作為植物誘導抗病激活劑的殺菌劑自身并無殺菌或抑菌活性，但可作為植物免疫系統(tǒng)的激活劑（Elicitor

16、），能在DNA轉錄水平上調控特殊代謝相關基因的表達及PR蛋白的產(chǎn)生，激發(fā)植物啟動自身的防御系統(tǒng)，以抵抗病原菌的侵染。這種現(xiàn)象通常稱為植物誘導抗病性（induced resistance），包括局部誘導抗病性和系統(tǒng)獲得抗性（SAR）。系統(tǒng)獲得抗性是植物病害防治研究領域的重要內容，指植物經(jīng)局部誘導后，在侵染點產(chǎn)生的抗病信號可傳播至其他非誘導部位而使植物產(chǎn)生抗病性的現(xiàn)象。,Mode of action - Actigard,Inductio

17、n of Systemic Acquired Resistance,1、烯丙異噻唑（PBZ）作用機制：具有內吸傳導作用，誘導水稻植株體內產(chǎn)生α-亞麻酸。亞麻酸是茉莉酸的前體，而茉莉酸是植物抗病反應中的重要信號分子，可增強與植物抗病性相關的酶的活性，并使侵染部位寄主細胞形成了類木質素的保護屏障。,2、苯并噻二唑（BTH)代表產(chǎn)品：苯并噻二唑-7-硫代羧酸甲酯，中文通用名為活化酯（acibenzolar）。典型植物誘導激活劑，

18、發(fā)病早期施用，對多種真菌、細菌病害產(chǎn)生防御作用，尤其是對白粉病、銹病、霜霉病效果顯著。,作用機制：具有較強內吸傳導作用，通過根部施藥可迅速被植物吸收和傳導到植株各個部位，激活植物的免疫系統(tǒng)，使其表現(xiàn)為“系統(tǒng)獲得抗性”。可誘導植物體內病程相關PR蛋白的產(chǎn)生，苯丙氨酸解氨酶、幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶、過氧化物酶等一系列防御酶系活性的提高，以及木質素和酚類物質含量的提高。包括使植物細胞產(chǎn)生乳狀突起、形成胼胝質等。,3、寡糖真菌病原Pm

19、g（Phytophthora megasperma f.sp.glycinea）的菌絲體壁上分離到帶分枝的β-1,3和β-1,6連接組成的葡聚七糖是首次被發(fā)現(xiàn)的寡糖激活劑。作用機制：寡糖可誘導植保素、蛋白酶抑制劑的合成以及與病程相關PR蛋白的積累，并可使苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶等多種防御酶系活性增強。,（四）殺菌農(nóng)用抗生素是指由細菌、真菌或放線菌等微生物產(chǎn)生的可以在較低濃度下殺死或抑制植物病原菌的次生代謝產(chǎn)物。作用位點單一

20、，大多是蛋白質合成抑制劑，靶標病原菌易對其產(chǎn)生抗藥性，不宜單一長期使用。,1、春雷霉素：水溶性內吸性抗生素，對稻瘟病、甜菜葉斑病、番茄葉霉病等真菌病害及黃瓜角斑病、蘋果炭疽病等細菌性病害都有良好的防效。作用機制：微生物蛋白合成抑制劑，通過氨酰-RNA與核糖體30S小亞基及70S大亞基結合抑制蛋白質合成，抑制菌絲生長。,2、多抗霉素：水溶性內吸性殺菌抗生素，對多種真菌病害，尤其是對交鏈孢菌引起的梨黑斑病、蘋果斑點落葉病、灰葡萄孢引起的

21、灰霉病防效好。作用機制：干擾病原菌細胞壁（幾丁質）合成，阻止病菌產(chǎn)生孢子和病斑擴大。,3、井岡霉素：水溶性抗生素，對立枯絲核菌引起的病害效果顯著，對水稻紋枯病有特效。作用機制：是立枯絲核菌AG-1海藻糖酶的抑制劑，能有效阻止紋枯病菌從菌絲的基部向頂端輸送營養(yǎng)（如葡萄糖），從而抑制菌絲的生長和發(fā)育。,,4、武夷菌素：1979年從福建省武夷山區(qū)采土分離出來的鏈霉菌。對黃瓜、花卉白粉病有明顯的防治效果，對番茄灰霉病、葉霉病、小麥白

22、粉病也有效。作用機制：能抑制菌絲蛋白質的合成，使細胞膜破裂，原生質滲漏。,第五章 殺菌劑在環(huán)境或生物體內的代謝,一、前言殺菌劑代謝——殺菌劑受生物體內多種因素或自然環(huán)境條件的影響而改變其化學結構的過程發(fā)生的變化涉及藥效、毒性和對環(huán)境的影響殺菌劑使用后的變化： 一是無酶參與的純化學分解（自然水解、氧化） 二是發(fā)生在有機體（植物、動物、微生物）代謝系統(tǒng)、由酶催化的生化反應。包括氧化反應、還原反應、水解作用及結合物的形成,

23、根據(jù)代謝后的活性/毒性變化分：1、失活代謝藥劑本身有活性，代謝后活性降低，或完全失效 。（多數(shù)） 2、活化代謝 藥劑離體時無殺菌活性，使用后代謝成有殺菌或抑菌活性的物質。 如：敵枯唑、稻枯磷、立枯靈、抑菌嗪酮、托布津、苯來特、三唑酮等3、增毒代謝 對高等動物而言，大多數(shù)藥劑的代謝最終變成無毒無害物質，但有的仍然保持相當?shù)亩拘?，或者變成毒性更高的物質，甚至致畸致癌，污染環(huán)境、危害人類。如：代森類,二、各類殺菌

24、劑的代謝途徑,殺菌劑在生物體或環(huán)境中的不同反應途徑： a: 動物；b: 細菌；e: 酶；f: 真菌；l: 光；p: 植物；s: 土壤；w: 水1、苯并咪唑類 苯來特和多菌靈（MBC）苯來特在溶液、微生物培養(yǎng)物、土壤、動植物體內脫去丁基氨基甲?；鶊F，形成多菌靈（MBC），但速度不同還可產(chǎn)生正丁胺及CO2正丁胺在大豆中能誘導羥基菜豆朊的生成羥基菜豆朊對植物有毒,2、托布津類甲基托布津及乙基托布津 環(huán)

25、化作用/關環(huán)反應?多菌靈及乙基多菌靈轉化條件：光、鄰苯醌、MFO3、丁烯酰胺類 萎銹靈及氧化萎銹靈動植物、土壤中：萎銹靈?亞砜的衍生物 （萎銹靈亞砜）?砜的衍生物（氧化萎銹靈）氧化萎銹靈毒性不及萎銹靈，但對銹菌的毒性比萎銹靈高，對黑粉菌特效 。,4、有機磷類（1）定菌磷 ? PP-定菌靈（活化）（2）異稻瘟凈?二異丙基磷酸酯（活化）5、嘧啶類（1）甲菌定和乙菌定 N-脫羥基作用，丁基羥基化，形成結合

26、物（2）抑菌嗪酮 ? 6-氮雜尿嘧啶（活化）,6、三唑類（1）三唑酮及三唑醇三唑酮 ?三唑醇影響活性因素：A 轉化程度；B三唑醇對映體組成；C 失活代謝過程；D 真菌對三唑醇單個對映體的敏感性7、代森類乙撐硫脲（ETU），致畸、致癌、阻礙甲狀腺功能在動物體內，能很快排出體外土壤及植物體內，能很快轉化成2-咪唑啉和乙撐脲8、有機氯類地茂散、菌核利,1.苯并咪唑類殺菌劑的代謝⑴苯菌靈(苯來特)

27、和多菌靈,三、殺菌劑代謝途徑詳解,⑵涕必靈和麥穗寧,2、托布津類,3、丁烯酰胺類及有關化合物⑴萎銹靈及氧化萎銹靈,⑵滅銹胺,⑶2，5－二甲基—3—呋喃甲酰替苯胺,⑷比銹靈,4、有機磷酸酯類⑴定菌磷,⑵克瘟散,5、嘧啶類及有關化合物 ⑴甲菌定和乙菌定,⑵丁嘧酯 ⑶十三嗎啉(克啉菌),⑷嗪胺靈,⑸抑菌嗪酮、卵菌靈和胺丙威,6、三唑類⑴三唑酮,影響三唑酮離體活性的有：①三唑酮轉化為三唑醇的程度；②三唑醇對映體的定性和定量組成；

28、③失活代謝過程；④真菌對三唑醇單個對映體的敏感性。根據(jù)真菌對三唑酮的代謝和敏感性的相互關系，可把一些真菌分為三種類型：(Ⅰ)對三唑酮和三唑醇均敏感；(Ⅱ)對這兩種化合物均不敏感；(Ⅲ)對三唑酮不敏感，但對三唑醇中等敏感。,⑵烯唑醇,7、代森類,8、有機氯類⑴稻瘟酞,⑵地茂散,Thank you!,分子克隆的基本操作技術,體外 剪切、拼接、重組,轉化 基因重組體（recombinant DNA）,基因產(chǎn)物,,,,目的基因的

29、獲得,PCR技術,酶切，連接策略,轉化技術，目的重組子的篩選,高效表達方法,,,聚合酶鏈式反應 (Polymerase Chain Reaction,PCR):一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法,又稱為基因的體外擴增法。1985年 美國Cetus公司 Mullis等人開發(fā)1993年 Mullis 諾貝爾化學獎,目的基因的獲得和序列分析,PCR 的反應體系,模板DNA（template）引物（primer）:與被分離的目

30、的基因的DNA雙鏈兩 端序列相互補的DNA，約20個堿基左右；TaqDNA 聚合酶／pfu高保真聚合酶；dNTP緩沖液（buffer）（PCR增強劑）一般PCR反應可擴增出100—5000bp的目的基因,PCR基本反應過程,1，變性 95℃，雙鏈解開成單鏈2，退火 55℃左右，引物配對3，延伸 72℃，合成新鏈30個循環(huán)左右,PCR 的目的?,引物的設計,1、引物長度（primer length）

31、 常用的是18-24 bp，不要大于38bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。,2. 引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。 另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫

32、度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。 若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引 物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。,3. 引物3′端不能選擇A，最好選擇T。 引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所

33、以3′端最好選擇T。,4. 堿基要隨機分布 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。,5. 引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。 引物的5′ 端決定著PCR產(chǎn)物長度，它對

34、擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。 引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。,給酶切位點添加保護堿基,限制性內切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內切酶穩(wěn)定的結合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很

35、大影響的，被稱為保護堿基。保護堿基常見于PCR引物設計時，為保護5` 端外加的內切酶識別位點，使酶切完全而添加。 其次，在分子克隆時，選擇載體的酶切位點也會碰到，相臨的2個酶切位點往往不能同時使用，因為一個位點切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點切割。,6. 引物自身及引物之間不應存在互補序列 引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而

36、影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。,7. 引物應具有特異性 引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步實驗了。,各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC

37、含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 至于設計軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應該可以的。,My protocol ?,My protocol ?,Bio-rad MJ researcher (2 block):S1: 95℃, 5’, (95℃ 45’’,

38、60℃ 1’ , 72℃ 2’)×30, 72℃ 10’, 4℃ forever : 1KbS2: 95℃, 5’, (95℃ 1’’, 60℃ 90’’ ,72℃ 4’) ×35, 72℃ 10’, 4℃ forever : 2 KbS3: 95℃, 5’, (95℃ 45’’, 60℃ 1’ , 72℃ 3’) ×30, 72℃ 10’, 4℃ forever : 1.4 Kb(extensio

39、n time=2 × DNA size),另外幾種PCR介紹,巢式PCR（Nest-PCR）遞減PCR（TouchDown PCR）重疊PCR （overlap PCR）逆轉錄PCR （RT-PCR）,巢式PCR（Nest-PCR）,,,巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同多套引物都互補的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5' RACE

40、）的特異性。,遞減 PCR（TouchDown PCR）,遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴謹?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm 5℃。,特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴增占據(jù)優(yōu)勢。,遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。,重疊PCR （over-lap PCR）,

41、將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。此技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術很快獲得其它依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。,逆轉錄PCR（RT-PCR）,由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA