免疫標記的應(yīng)用與評價

1、免疫標記的應(yīng)用與評價,上海交通大學(xué)瑞金臨床醫(yī)學(xué)院,免疫標記的應(yīng)用,干細胞的確定CD34/CD38/CD90HPC/PBSC定量分析1.移植治療的日益普及2.移植門檻的降低3.干細胞采集的確定4.有效干細胞的確定要求(CD34、CD90、CD38等),CD34+的分析： 未動員前外周血中CD34+細胞1～4%，CD34+/CD38-細胞1/2500，CD34+/CD38-/CD90+細胞1/10000。 各家單抗

2、不同、操作不一，結(jié)果難以比較。 內(nèi)毒素、單純化療（骨髓抑制）、細胞因子、化療聯(lián)合細胞因子 等的動員。,,淋巴細胞和NK細胞確定和定量分析淋巴細胞分化增殖異常的信號淋巴細胞與髓系細胞的鑒別混合性白血病和未確定性(型)白血病的診斷造血干細胞病變的信號疾病的預(yù)后判斷,T細胞標記 T細胞及其亞群 T祖細胞（pro-T）的表型為CD34+、TdT+、CD10+、CD7+、未成熟T細胞標志

3、CD3、CD4和CD8。在T細胞發(fā)育過程中，CD7是最早出現(xiàn)的T細胞標志，且貫穿表達在整個T細胞分化發(fā)育過程中。胸腺細胞要分化發(fā)育為有功能的成熟T細胞，細胞表面標志需經(jīng)歷一定的變化過程。,從CD7+、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-→CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR-（即CD4、CD8雙陰性）→CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+（即CD4、CD8雙陽性），最后發(fā)育

4、成CD7+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8-、TCR+和CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8+、TCR+單陽性的兩群成熟胸腺細胞，然后進入外周淋巴器官和血液，執(zhí)行免疫功能。,但在正常外周血中通常存在CD3+、CD4+、CD8-（TH/TI），CD3+、CD4-、CD8+（TS/TC），CD3+ CD4+ CD8+和CD3+ CD4- CD8-四種表型不同的T細胞，它們分別占T細胞總數(shù)的60%~70%，20%~30%，1%

5、~3%，1%~10%。前三種表型細胞的TCR主要為TCRαβ，而CD4- CD8- T細胞主要表達TCRγδ，他們都執(zhí)行細胞免疫功能。,CD2是綿羊紅細胞受體和淋巴細胞功能相關(guān)抗原-2（LFA-2），表達于人95%T細胞、50%～70％胸腺細胞和大顆粒淋巴細胞（LGL／NK）的表面。CD3是T細胞表面抗原，表達于成熟胸腺細胞、靜息和激活的的外周血T細胞，是鑒定T細胞的重要標志，其胞漿和膜CD3是早期和普通型T細胞白血病的主要分型標記。,

6、CD5、CD7是T細胞白血病較特異的標記，也是髓系白血病時最常見的伴隨標記。CD15、CD45則是白細胞的共同標記抗體，在淋巴瘤的診斷中有一定的價值。而CD25和CD28主要分布于活化T淋巴細胞表面，為活化T淋巴細胞標志。胸腺細胞、靜止T細胞、靜止B細胞以及NK細胞表面無表達。主要用于淋巴細胞疾病的免疫分型。外周血淋巴細胞CD25+、CD28+占54%～86%,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和II類人類白細胞抗原（HLA-DR）的陽性表

7、達對早期T細胞白血病的診斷有重要價值。TCRα、β、γ的基因重排檢測有利于惡性T細胞疾病細胞異?？寺〈嬖诘拇_定。 另外，80％～90％和95％以上的NK細胞表達CD16和CD56。用CD3-CD16+CD56+可定義NK細胞。,B細胞標記,B細胞 B細胞的分化主要分為B祖細胞、前B細胞、未成熟B細胞、成熟B細胞、活化B細胞和漿細胞6個階段。 （1）B祖細胞（pro-B）：此期最早識別的B細胞特異性抗原是CD19，同時表達

8、CD34、細胞核TdT、HLA-DR、CD40、CyCD22。 （2）前B細胞（pre-B）：CD34和TdT消失，出現(xiàn)CyCD79、CD10、CD20、CD9、CDw78、CD74，cμ+（胞漿IgM重鏈）。,（3）未成熟（早期）B細胞（immature B cell）：CD9、CD10消失，出現(xiàn) SIgM、CD22。CD20、CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表達增加。其他新的B抗原CD37、CD2、

9、CDw75、CDw76相繼出現(xiàn)。 （4）成熟B細胞（mature B cell）：SIgM和IgD同時表達，并出現(xiàn)CR、FcR和絲裂原受體，上述B細胞抗原繼續(xù)存在。,（5）活化B細胞（activated B cell）：成熟B細胞被抗原或絲裂原刺激后，成為活化B細胞，繼之增生和分化。在此過程伴隨表達B細胞激活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相關(guān)抗原如CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、CD71、

10、CD38等。膜結(jié)合型Ig逐漸減少，分泌型Ig逐漸增加，并可發(fā)現(xiàn)Ig基因重鏈類型轉(zhuǎn)換。 （6）漿細胞（plasma cell）：激活B細胞進一步分化成為產(chǎn)生抗體的漿細胞，這時獲得PC-1、PCA-1和CD138漿細胞特異抗原，CD85表達增加，CD38抗原再出現(xiàn)。而SIg和上述B抗原消失。CD79仍可存在于胞質(zhì)中。,B細胞上的CD抗原分為：①B細胞限制性（特異性）抗原： CD19、CD20、CD21、 CD22、CD77 和CD79

11、， 它們的表達只限于B細胞上，在鑒別細胞系上是十分重要的標志。②B細胞相關(guān)性抗原： CD5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。而B細胞表面的受體SIg，是B細胞特異性識別抗原的受體，也是B細胞重要的特征標志。,CD19、CD20、CD21、CD22和CD2

12、4都是B細胞白血病和淋巴瘤最常用的標記抗體。對中國人而言，CDl9是特異性和敏感性最高的。CD19是一種早期的、譜系特異的泛B細胞表面抗原，從最早期B細胞前體細胞階段即表達，持續(xù)存在直至B細胞終末階段，分化為漿細胞時丟失。CD19存在于90％外周血、脾臟、淋巴結(jié)或扁桃體中的B細胞和近5％的骨髓細胞。在造血系統(tǒng)CD19只表達于正常和惡性B細胞。外周血T細胞、單核細胞、粒細胞和血小板表面不表達CD19。CD24對B細胞白血病細胞表達的敏感性

13、接近CD19，且有較高的特異性。CD20和CD22與CD19和CD24有相同的特異性，但敏感性不夠，CD20的表達往往伴隨性CD19的陽性而出現(xiàn)。,CD10、TdT都是早期B細胞的標記，其中CD10的表達可出現(xiàn)在90%的B系統(tǒng)ALL的原始細胞上。一般來說，這類白血病患者有超過一半，甚至三分之二以上，在免疫表型中出現(xiàn)淋巴細胞分化的明顯不協(xié)調(diào)，如，CD22陽性與CD10表達同時出現(xiàn)在ALL白血病細胞上。而免疫球蛋白重鏈（IgH）的基因重排更

14、是B細胞異?？寺⌒栽錾臉擞洝．惓Ｔ錾寺⌒訲細胞也有15%～20%呈現(xiàn)IgH的基因重排。,髓系細胞標記,這類抗體包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、CD61、CD63和CD117等。這些免疫標記種類繁雜，缺乏特異性和敏感性（與淋巴細胞標記抗體相比）。很多情形下，上述標記也出現(xiàn)在正常的髓細胞表達上。,3.髓系標記 從髓系祖細胞→終末分化的成熟細胞（粒細胞、單核細胞、

15、血小板和紅細胞）間各階段細胞特征性標志還不十分清楚。根據(jù)粒細胞和單核細胞上的髓系抗原表達試將其大致分為七種類型 :（1）粒細胞和單核細胞上都有較強表達的抗原有：CD13、CDw17、CD32、CD87、CD88、CD89、CDw92、CD93、CD156、CD157、CD163。其中CD13在原粒細胞質(zhì)中表達比膜上早，在AML診斷上十分重要。（2）以粒細胞為主，但也存在于單核細胞的抗原有：CD15和CD65。CD65是特異性髓系抗

16、原，強表達在成熟粒細胞，弱表達在單核細胞上。 （3）基本表達在粒細胞上的抗原有：CD16b和CD66。,（4）以單核細胞為主，但也表達在粒細胞的抗原有：CD14和CD33。CD14主要強表達在單核-巨噬細胞，弱表達在粒細胞上。CD33抗原分布只限于造血系統(tǒng)內(nèi)，表達在髓系祖細胞CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相應(yīng)的白血病細胞上。約80%AML原粒細胞表達CD33抗原，而終末分化的粒細胞CD33抗原弱表達。CyC

17、D33先于mCD33表達，故在AML-M0診斷上CyCD33加CyCD13十分有用。 （5）基本只表達在單核細胞上的抗原有：CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是目前發(fā)現(xiàn)可靠的檢測造血系統(tǒng)內(nèi)單核-巨噬細胞系統(tǒng)的特異標志，用CD68單抗可將AML-M1～M3與AML-M4及AML-M5區(qū)別開來。,（6）造血干、祖細胞抗原有：CD34和CD90。CD34和CD90雖列在髓系抗原中，但都屬于造血干、祖細胞

18、抗原 。CD34除表達在早期造血干、祖細胞外，還表達在約40%的AML和60%的ALL上，這些CD34+的白血病細胞可能來自具有多系性分化能力的分化不良的前身細胞。 （7）其他髓系相關(guān)抗原：這些抗原主要存在于其他系細胞上，但在某些髓系細胞上也有表達，如：CD4、CD7、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、CD38等。,巨核細胞系 在巨核細胞系發(fā)育過程中依次出現(xiàn)PPO、CD41a（Ⅱb/Ⅲa）、CD41b（Ⅱ

19、b）和CD61（Ⅲa）、CD42（Ⅰb）。還可表達CD36（強）。血小板具有豐富的胞內(nèi)顆粒，正常情況下血小板處于靜止狀態(tài)。目前研制出的抗血小板單抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、 CD42b、CD61，主要都針對靜止的血小板。當血小板被激活時，血小板中顆粒內(nèi)容物釋放，整合到活化的血小板質(zhì)膜內(nèi)，成為一些激活抗原，如CD62 （P-選擇素）、CD63及CD107a和CD107b。 紅細胞系

20、血小板GPⅢb （CD36強）、血型糖蛋白A、H。,4.干祖細胞系 CD34抗原選擇性地表達在不成熟的造血干細胞、祖細胞上，是一個階段特異而非系特異的抗原。多能造血干細胞（CFU-GEMM）和定向造血干細胞（CFU-GM，CFU-Meg、BFU-E、BFU-Eo、CFU-Bas）、T祖細胞（pro-T）、B祖細胞（pro-B）都在CD34+群內(nèi)。CD34+抗原在早期造血祖細胞內(nèi)呈高水平表達，隨著細胞成熟其表達呈進化性下降，繼而消失

21、。目前CD34已作為能識別人類最早造血干、祖細胞的重要標志。現(xiàn)知更早期的干細胞為CD34-。,CD34+、CD38-細胞在形態(tài)上缺乏分化特點，是更幼稚、能維持長期造血的啟動細胞（LTC-IC）。LTC-IC細胞以CD34+、CD45RO+、HLA-DR-為主，多處于G0和G1期。CD34+、CD38+細胞則大多處于造血祖細胞階段，可形成各系造血集落，但不能維持長期造血。故CD38抗原是造血干細胞向多系定向分化的標志之一，并隨一定的分化過

22、程表達上調(diào)。鑒于CD34抗原可以識別出造血干、祖細胞，結(jié)合其它相關(guān)分化抗原的表達可以作為造血細胞不同發(fā)育階段的標志。如CD34+、CD33+細胞群為多能干細胞向髓系定向的標志。CD34+、CD19+多為多能干細胞向B系定向的祖細胞。而CD34+、TdT+、CD10+、CD7+則被認為是向T系定向的祖細胞。,最近發(fā)現(xiàn)CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖細胞標志，故現(xiàn)人們多把CD34-、CD90+，Lin-細胞視為造血干細胞的重要

23、標志。,CD15則在分化較好的AML中表達；血型糖蛋白A表達在除紅系祖細胞外的紅系細胞上，占FAB M6患者的40%左右，CD71可彌補血型糖蛋白A的不足，在爆式紅系細胞集落形成單位（BFU-E）和紅系細胞集落形成單位（CFU-E）階段的祖細胞亦可表達陽性；CD41、CD42和CD61是常用的原始巨核細胞標記，但CD61往往隨CD41、CD42的陽性而表達。另外，CD56作為神經(jīng)細胞粘附分子（NCAM）通常在NK細胞和T細胞上表達。在1

24、3%～41%的AML中，CD15表達陽性；在分化的單核細胞和t（8;21）、+8等核型改變時，也呈陽性表達。,MPO、HLA-DR、TdT和溶菌酶抗體在髓系細胞上也應(yīng)用極廣。其中，除原始單核細胞白血病、巨核細胞白血病和紅系白血病外，其他髓系白血病細胞都有可能陽性；HLA-DR除早幼粒細胞白血病外，其他髓系白血病均可呈陽性；TdT僅表達在極微分化的早期髓系細胞上；溶菌酶可部分彌補CD14、CD36對原始單核細胞的不敏感。,特殊檢驗的應(yīng)用,

25、慢淋問題(活化的淋巴細胞標記)惡組問題(附帶的T/B細胞標記)慢性白血病的標記要慎重,Acute myeloid leukaemia,Acute myeloid leukaemia with recurrent genetic abnormalitiesAcute myeloid leukaemia with multilineage dysplasiaAcute myeloid leukaemia and myelodyspl

26、astic syndrome, therapy-relatedAcute myeloid leukaemia not otherwise categorized,Acute myeloid leukaemia,Acute myeloid leukaemia,Acute myeloid leukaemia,The blast % is lowered from 30% (FAB) to 20% (WHO) Median age of

27、onset = 60 yrsIncidence 4 –10 / 100,000Etiology,Myeloblasts versus lymphoblasts,Acute myeloid leukaemia,Acute lymphoblastic leukaemia,Acute myeloid leukaemia: cytochemistry,MyeloperoxidaseSudan Black BNon-specific es

28、terasea-naphthyl butyratea-naphthyl acetate,Cytochemistry: MPO,Cytochemistry: NSE,Cytochemistry,Acute myeloid leukaemia: role of immunophenotyping,Distinction of minimally differentiated AML from acute lymphoblastic le

29、ukaemiaRecognition of AML-M7Recognition of specific AML sub-categories (e.g CD56+ve AML)Diagnosis of biphenotypic leukaemiaHowever, immunophenotyping is not mandatory in typical cases of AML, unlike in ALL where a p

30、henotypic diagnosis is needed in every case,Acute myeloid leukaemia: role of immunophenotyping,Panel of monoclonal antibodies in classification of acute leukaemia,Haemopoietic precursors: CD34, HLA-DR, Tdt, CD45B-lineag

31、e: CD19, CD20, CD22, CD79aT-lineage: CD2, CD3, CD5, CD7Myeloid: CD13, CD33, CD117, anti-MPOMegakaryocytic: CD41, CD61,Acute myeloid leukaemia with recurrent genetic abnormalities,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q

32、22;q22); AML1/ETOAcute myeloid leukaemia with abnormal bone marrow eosinophils and inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22); CBFb/MYH11Acute promyelocytic leukaemia (AML with t(15;17)(q22;q12); PML/RARa and variantsAcute

33、myeloid leukaemia with 11q23 (MLL) abnormalities,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,t(8;21) is the commonest translocation in AMLAssociated with AML-M2 morphologyTumour masses (granulocytic sarcoma

34、),Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,MorphologyLarge blasts, heavily granulatedFrequent Auer rodsVariable dysplasia in granulocytic seriesRare cases with blast count < 20%ImmunophenotypeCD13

35、+ CD33+ anti-MPO+CD19+CD34+CD56±,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,Detection

36、of fusion genes by FISH,Detection of fusion genes by FISH,Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22); AML1/ETO,PrognosisGood response to chemotherapy and high complete response rateLong term disease free survivalAd

37、verse factorsadditional chromosomal changes e.g. 9q-CD56 +ve,Acute myeloid leukaemia with inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22); CBFb/MYH11,Granuolocytic and monocytic featuresAML-M4 (acute myelomonocytic leukaemia) mo

38、rphologyAbnormal eosinophils with coarse basophilic granules,Acute myeloid leukaemia with inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22); CBFb/MYH11,Acute myeloid leukaemia with inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22); CBFb/MYH11,Cy

39、tochemistryAbnormal eosinophils are CAE +veImmunophenotypeGranulocytic and monocytic markersCo-expression of CD2 in blast populationPrognosisFavourable,Acute myeloid leukaemia with inv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q

40、22); CBFb/MYH11,Acute promyelocytic leukaemia,AML with t(15;17)(q22;q12); PML/RARa and variantsCharacteristic morphologyAssociated with disseminated intravascular coagulation,Acute promyelocytic leukaemia,Acute promyel

41、ocytic leukaemia,Acute promyelocytic leukaemia,ImmunophenotypeCD33+ CD13+HLA-DR and CD34 negativeCo-expression of CD2 and CD9Geneticst(15;17)(q22;q12)Variants: t(11;17)(q23;q12) PLZF/RARa; t(5;17)(q32;q12) NPM/RARa

42、; t(11;17)(q13;q12) NuMA/RARa,Acute promyelocytic leukaemia,Acute promyelocytic leukaemia,TreatmentAll-trans retinoic acid (ATRA)Arsenic for relapse casesRARa variants: resistant to ATRAPrognosisFavourable when trea

43、ted optimally with ATRA followed by anthracyclines,Acute myeloid leukaemia with 11q23 abnormalities,Infant leukaemiaTherapy related AML after exposure to DNA topoisomerase II inhibitorsAcute monocytic and myelomonocyti

44、c leukaemiaAssociated with MLL rearrangement,Acute myeloid leukaemia with multilineage dysplasia,Following MDS or MDS/MPDWithout antecedent MDSDysplasia in ? 50% of cells in at least 2 linesPoor prognosis,AML and M

45、DS, therapy related,Alkylating agent relatedTopoisomerase type II inhibitor related,Acute myeloid leukaemia not otherwise categorized,Equivalent to FAB classificationAML minimally differentiatedAML without maturation

46、AML with maturationAcute myelomonocytic leukaemiaAcute monoblastic and monocytic leukaemiaAcute erythroid leukaemiaAcute megakaryoblastic leukaemiaAcute basophilic leukaemiaAcute panmyelosis with myelofibrosisMyel

47、oid sarcoma,AML without maturation,Acute myeloid leukaemia with maturation,Acute monocytic leukaemia,Erythroleukaemia,Acute leukaemia of ambiguous lineage,Mixed myeloid and lymphoid characteristicsBiclonal (two clones)