生物地球化學(xué)性疾病研究進(jìn)展

1、生物地球化學(xué)性疾病研究進(jìn)展,Research Progress on Biogeochemical Disease,預(yù)防醫(yī)學(xué)研究的主題,,人與環(huán)境,人是環(huán)境的產(chǎn)物，組成人體的物質(zhì)都是來自其環(huán)境在自然界，目前已知天然存在的化學(xué)元素有92種，而在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了81種英國地球化學(xué)家Hamilton測試220名英國人血液和地殼與海水的化學(xué)組分及其含量，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的豐度相關(guān) 人體的化學(xué)元素組成，在種類和含量上都與地

2、殼表層的元素組成密切相關(guān),生物地球化學(xué)性疾病,由于地殼表面化學(xué)元素分布的不均勻性，使某些地區(qū)的水、土壤、植物和煤中等介質(zhì)個(gè)別元素含量過多或過少，使當(dāng)?shù)氐娜嘶騽?dòng)物從外環(huán)境中獲得的某種元素的量超過或不能滿足機(jī)體正常的需要量所引起的特異性疾病，稱生物地球化學(xué)性疾?。╞iogeochemical disease） 由于這類疾病的發(fā)病特點(diǎn)具有明顯的地區(qū)性，故又稱為地方?。╡ndemic disease）

3、 某些在特定地域內(nèi)經(jīng)常發(fā)生并相對(duì)穩(wěn)定，與地理環(huán)境中物理、化學(xué)和生物因素密切相關(guān)的疾病— endemic disease,地方病,化學(xué)元素性地方病（生物地球化學(xué)性疾?。?病因?yàn)榄h(huán)境介質(zhì)中某種（些）元素或化合物過多、不足或比例失常，再通過食物和飲水作用于人體所致的疾病自然疫源性地方?。▊魅静。?病因?yàn)槲⑸锖图纳x，是一類傳染性的地方病，包括鼠疫、布魯鼠疫、布魯氏菌病、乙型腦炎、森林腦炎、流行性出血熱

4、、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、黑熱病、肺吸蟲病、包蟲病等,生物地球化學(xué)性疾病分類,元素過多型元素缺乏型,全國約有70多種，主要分布于廣大農(nóng)村、山區(qū)、牧區(qū)等偏僻地區(qū)，病區(qū) 呈灶狀分布除上海市外的29個(gè)省、自治區(qū)、直轄市均有不同程度的地方病發(fā)生， 有的地區(qū)可多達(dá)五六種，受威脅人口多達(dá)4.2億多我國重點(diǎn)防治的地方病有：地方性氟中毒，地方性甲狀腺腫，地方性克 汀病，大骨關(guān)節(jié)炎，克山病等我國分布最廣的地方病

5、：地方性氟中毒，地方性甲狀腺腫，地方性克汀 病三種,我國生物地球化學(xué)性疾病的流行現(xiàn)狀,地方性氟中毒是我國目前重點(diǎn)防治的八種地方病之一。就流行范圍之廣和罹患人數(shù)之多而言，地方性氟中毒無疑是當(dāng)前對(duì)我國危害最嚴(yán)重的地方病 根據(jù)目前所掌握的資料，除上海市外，全國各省、自治區(qū)、直轄市均有不同程度的地方性氟病發(fā)生和流行。2000年全國普查發(fā)現(xiàn)，我國現(xiàn)有地氟病流行的縣（市、旗）多達(dá)1306個(gè)，病區(qū)人口3.3億，患氟斑牙4066萬人

6、，氟骨癥人數(shù)為260萬,Research progress on Endemic Fluorosis地方性氟中毒研究進(jìn)展,病因：Fluorine,其發(fā)生原因主要是由于巖石土壤、煤、水、食物和/或空氣中氟含量較高，居民長期攝入含氟量較高的飲水、食物或空氣而引起的疾病,Endemic fluorosis,由于一定地區(qū)的環(huán)境中氟元素過多，使生活在該環(huán)境中的居民經(jīng)飲水、食物和空氣等途徑長期攝入過量氟而引起的以氟骨癥（skeletal f

7、luorosis）和氟斑牙（dental fluorosis）為主要特征的一種慢性全身性疾病,氟在環(huán)境中的分布,化學(xué)性質(zhì)最活潑，在常溫下能同所有的元素相互作用氧化性最強(qiáng)的物質(zhì)，沒有任何一種氧化劑能將其從化合物中置換出來 自然界中的氟是以化合物形式而不是以單質(zhì)的形式存在,環(huán)境介質(zhì)中氟含量,巖石（平均550mg/kg）及土壤地下水>地面水空氣中氟含量較低：工業(yè)區(qū)、商業(yè)區(qū)、生活區(qū)海產(chǎn)動(dòng)物>陸生動(dòng)物

8、：骨組織、筋腱動(dòng)物性食品> 植物性食品糧食>葉類蔬菜>果實(shí)類蔬菜磚茶氟含量高：100mg/kg,氟的生物學(xué)效應(yīng),氟對(duì)人體的效應(yīng)與劑量有關(guān)，低劑量無生理作用，適宜劑量有生理作用，高劑量則引起中毒。 人體每日需氟量約為1.0mg ? 1.5mg，最大安全攝入量3mg/d ? 4mg/d。若每日攝氟量超過6mg，就可能引起氟中毒。,適宜劑量,（1）維持機(jī)體正常的鈣磷代謝，促進(jìn)牙齒和骨骼鈣化骨骼：生活

9、在低氟區(qū)居民攝入氟過低可引起骨密度下降及骨質(zhì)疏松，臨床上給以適量氟可收到較好防治效果骨折：易發(fā)生骨折和適量氟有助于骨折愈合牙齒：防齲表面形成氟磷灰石保護(hù)層可增強(qiáng)牙機(jī)械強(qiáng)度適量氟可增強(qiáng)牙釉質(zhì)的抗酸蝕能力—提高抗齲能力（氟化物防齲的原因）對(duì)口腔內(nèi)細(xì)菌和酶的抑制作用可減少酸性物質(zhì)的產(chǎn)生氟與口腔液體中磷酸根、鈣離子共同作用，引起釉質(zhì)表面再礦化，增強(qiáng)牙齒抗齲齒原因,適宜劑量,（2）對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)及膽堿酯酶和三磷酸腺苷酶等酶代謝有一定作用

10、 （3）對(duì)機(jī)體的造血機(jī)能和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有影響,關(guān)于氟的生物學(xué)效應(yīng)方面，目前存在爭論的主要問題,必需微量元素（essential trace element）氟化水預(yù)防齲齒,International Society for Fluoride Research（ISFR）Journal: Fluoride,電解鋁、冶煉、磷肥等工業(yè)企業(yè)由于釋放大量氟化物嚴(yán)重污染當(dāng)?shù)丨h(huán)境，致使這些工業(yè)企業(yè)周圍樹木枯萎，牛羊患氟骨癥，兒童

11、氟斑牙癥大量發(fā)生（湖北大冶、江蘇常熟等）。 嚴(yán)格地說這并不屬于地方性氟中毒范疇，但值得注意的是，此種污染如長期下去，氟在環(huán)境中長年累積，經(jīng)過若干年后，即有可能形成次生性氟地球化學(xué)病區(qū)，應(yīng)引起足夠的重視。,氟化水防齲齒？？,發(fā)達(dá)國家發(fā)展中國家和貧窮國家,氟化水,氟化鈉、氟硅酸鈉、氟硅酸氟硅酸鹽氟化水（SiFW）與氟化鈉處理水（NaFW）兒童血鉛升高（SiFW嚴(yán)重腐蝕銅制水管，導(dǎo)致閥門處水鉛升高）Si

12、FW抑制膽堿酯酶的作用，危害性更加嚴(yán)重： NaFW中是完全解離的氟化物，而SiFW有少量完全解離的SiF6離子或低分子量的硅酸低聚物可以繼續(xù)存留在SiFW,地方性氟中毒類型,飲水型氟中毒 drinking water fluorosis 最主要的氟中毒類型：分布最廣、影響面最大、

13、 危害最嚴(yán)重、流行史最長 全國飲水型病區(qū)人口大約有7800萬 燃煤型氟中毒 coal-burning fluorosis 20世紀(jì)70年代后發(fā)現(xiàn)的第二大類型的氟中毒 14個(gè)省197個(gè)縣中，受威脅人口約5000萬人 飲茶型氟中毒 brick-tea fluorosis,世界氟病區(qū)分布圖,過量氟的毒作用,對(duì)鈣磷代

14、謝的影響 對(duì)骨、牙齒的影響 對(duì)其它組織的影響抑制多種酶的活性,慢性氟中毒的非骨相損害,地方病學(xué)研究工作者對(duì)氟的非骨相損害做了大量的研究工作。除了繼發(fā)于骨性壓迫的神經(jīng)肌肉損害和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)外，是否還存在其他組織器官（非骨相組織）的明顯的原發(fā)性損害，仍缺乏肯定的、普遍認(rèn)同的結(jié)論。,氟中毒非骨相損害的臨床病理學(xué)研究的難度,①難以建立早期非特異、輕微的癥候與本病的必然聯(lián)系；②難以獲得數(shù)量足夠的尸檢資料進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察；

15、③難以把過量氟所致原發(fā)性損害與繼發(fā)、并發(fā)的病變明確區(qū)分開來；④有相當(dāng)一部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外研究則主要反映投予超大劑量時(shí)氟的一般毒性作用。,腦損害,自1937年Shoutt首次報(bào)道氟骨癥患者伴有神經(jīng)系統(tǒng)損害和1980年謝大釗報(bào)道氟中毒病區(qū)先天性癡呆發(fā)生率與飲水氟含量有關(guān)以來，氟中毒對(duì)人和動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的影響已逐步引起人們的關(guān)注，并經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)。,大部分人群調(diào)查和動(dòng)物染氟研究顯示：

16、 氟可通過胎盤屏障和血腦屏障，蓄積于胎兒腦組織，影響胎兒腦發(fā)育，對(duì)兒童和仔鼠的智力產(chǎn)生明顯的影響，主要表現(xiàn)為智力（IQ）下降，學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知能力降低，行為改變等神經(jīng)毒性。,病理,氟病區(qū)5-8個(gè)月引產(chǎn)胎兒：大腦、海馬及腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞和未分化神經(jīng)母細(xì)胞的數(shù)密度和核質(zhì)比增高，神經(jīng)細(xì)胞平均體積降低，線粒體的數(shù)密度、體積密度及表面積密度降低，表明過量氟對(duì)腦組織的發(fā)育分化有一定的影響。 利用CT檢查氟骨癥患者腦

17、組織顯示腦皮質(zhì)部密度普遍比正常人高，有硬化狀改變，間隙不清，并有部分患者有不同程度的腦組織鈣化，以枕葉和額葉為主。在染氟的大鼠、小鼠上也可觀察到類似的病理學(xué)改變。 目前認(rèn)為過量氟可直接造成神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性損傷。,機(jī)制,氟通過胎盤屏障和血腦屏障蓄積靶部位－海馬，引起與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)－海馬CA3、CA4和齒狀回等區(qū)突觸亞微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理性改變和神經(jīng)元的退化，降低與學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)的煙堿樣乙酰膽堿受體的數(shù)量和表達(dá)，以及影響多

18、種與細(xì)胞增殖、分化、凋亡相關(guān)基因（c-fos, c-jun，G蛋白等）的表達(dá)。 從氟的致病機(jī)制上，認(rèn)為氟對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響與氟引起海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、DNA損傷和神經(jīng)元的凋亡等密切相關(guān)。由于氧化應(yīng)激是氟引起多種細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，DNA損傷又可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，因此，人們推測細(xì)胞凋亡是氟致神經(jīng)毒性的關(guān)鍵因素之一。,地氟病患者是否存在肝損害？,肯定： 人群：Michael等調(diào)查飲用高氟水

19、對(duì)人體軟組織功能影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，氟可引起蛋白質(zhì)合成障礙，血清ALT和AST活性升高；Shivashankara等研究也發(fā)現(xiàn)氟骨癥兒童血清中多項(xiàng)肝功能指標(biāo)異常；Scsheela等報(bào)到地氟患者血清糖蛋白降低，氨基多糖、涎酸降低30％；侯立中曾連續(xù)2年相同季節(jié)對(duì)氟斑牙和氟骨癥患者血清多種酶進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)LDH、α－羥基丁酸脫氫酶活性明顯升高；湯瑞琦等檢測重癥氟骨癥村兒童的多種血液生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)氟可引起兒童體內(nèi)蛋白質(zhì)合成障礙，血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高與血

20、清氟一致。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飲水氟濃度與肝損害存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。,8～14歲兒童血清TP和ALB含量測定結(jié)果,各組人群的血清總蛋白和白蛋白含量均在正常值范圍之內(nèi)，各組人群之間無顯著性差異,8～14歲兒童血清ALT、AST和LDH活性,飲水氟含量為2.15～2.96 mg/L之間和飲水氟含量高于3.0 mg/L地區(qū)的氟斑牙患者，血清LDH活性與對(duì)照組和高氟負(fù)荷人群相比，均顯著升高，并隨飲水氟含量增加而升高，提示

21、飲用氟含量高于2.0 mg/L的水可能會(huì)引起兒童肝損害，且損害程度隨飲水氟含量增加而加重。,否定：,梁超柯等分析了6個(gè)不同飲水氟濃度地區(qū)的成人血清中TP、ALB、AST、總膽紅素等肝功能指標(biāo)，均未發(fā)現(xiàn)顯著性改變；即使在生活在飲水氟含量為1.5～23.0 mg/L（平均8.87 mg/L）的地區(qū)人群，也未觀察到肝臟損害。李廣生等在用家兔氟中毒試驗(yàn)中，用全自動(dòng)生化分析儀測定血清中反映各臟器功能和全身代謝情況的23項(xiàng)指標(biāo)中，結(jié)果飲水投予200

22、mg/L的中劑量組，盡管骨骼病變已十分明顯，但所有23項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比均無明顯差異，心、肝、腎等組織亦未見明顯壞死改變。,地氟病患者是否存在腎損害？,肯定： 大量的研究人群調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均證實(shí)：過量氟可以使腎的結(jié)構(gòu)和功能受到損傷否定： Leone等觀察生活在飲水氟含量8mg/L達(dá)10年之久的美國得克薩斯州居民，未發(fā)現(xiàn)有腎臟疾病或腎功能障礙增多,8～14歲兒童尿NAG、γ-GT活性測定

23、結(jié)果,飲水氟含量為2.15～2.96mg/L的地區(qū)，氟斑牙組尿液NAG、γ-GT活性與對(duì)照組相比顯著升高，而在飲水氟含量高于3.0mg/L的地區(qū)，無論氟斑牙組還是高氟負(fù)荷組人群尿液NAG、γ-GT活性均顯著高于對(duì)照組，且這一地區(qū)兩組人群的γ-GT活性均顯著高于飲水氟含量為2.15～2.96mg/L地區(qū)，說明飲用水氟含量高于2.0mg/L的水引起兒童腎臟損害，且損害程度隨飲水氟含量增加而加重。,但在飲水氟含量相同的地區(qū)，氟斑牙患者組和高氟

24、負(fù)荷組的尿液NAG和γ-GT活性無顯著性差異，提示是否患氟斑牙，與腎功能損害程度并無直接關(guān)系，腎損害主要取決于飲水中的氟含量。,氟中毒的毒性作用機(jī)制,,F2-,Ca2+,Ca2+降低,缺鈣綜合癥,甲狀旁腺,牙齒,骨組織,CaF,,,,,,,,,,毒作用機(jī)制,低營養(yǎng)低鈣學(xué)說（鈣矛盾疾病學(xué)說）自由基與氧化應(yīng)激學(xué)說鎂學(xué)說,鈣矛盾疾病,2000年日本Fujita和Palmieri把在發(fā)病機(jī)制中有鈣矛盾參與并起重要作用的疾病都?xì)w入鈣矛盾疾

25、?。–alcium paradox disease）。 鈣矛盾疾病應(yīng)具備以下三個(gè)環(huán)節(jié)：（1）全身缺鈣；（2）繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)，趨鈣激素（PTH） 分泌增多；（3）全身Ca2+內(nèi)流增多。,鈣矛盾疾病學(xué)說（骨相組織）,1、膳食低鈣是氟骨癥的主要促發(fā)和加重因素，地氟病特別是氟骨癥存在整體缺鈣――靶細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高現(xiàn)象，從發(fā)病機(jī)制上屬于鈣矛盾疾病。 2、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞激活和骨轉(zhuǎn)換加速是

26、過量氟干擾骨代謝的主要環(huán)節(jié)，骨轉(zhuǎn)換加速是形成骨病變多樣性的基礎(chǔ)。 3、膳食低鈣不僅促進(jìn)腸道氟的吸收和骨氟的沉積，而且它本身就可啟動(dòng)成骨、破骨活躍和加速骨轉(zhuǎn)換，與氟的骨骼效應(yīng)具有高度一致性，即氟的作用有相當(dāng)部分是通過使體液Ca2+降低和細(xì)胞Ca2+內(nèi)流增多來介導(dǎo)的。因此，高氟與低鈣結(jié)合在一起，骨損害就會(huì)明顯加重。 4、過量氟通過干擾趨鈣激素（PTH）、局部細(xì)胞因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

27、，使其向不同方向偏移，從而導(dǎo)致各種病理后果。,供鈣充分,環(huán)境氟暴露,供鈣不足,腸管氟,血氟,PTH 及其他機(jī)制,細(xì)胞內(nèi)Ca2+,靶組織氟,骨晶氟,ECM及膠原損害,OB激活,OC激活,骨周化骨,骨硬化,骨軟化,非骨相損害,骨質(zhì)疏松,氟骨癥機(jī)制圖解,,,,,,,,,,,,,,,血鈣,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(+),(-),(+),(-),(+),(+),化骨前沿缺鈣,原鈣化骨吸收,,,自由基與氧化應(yīng)激學(xué)說

28、（非骨相組織）,研究對(duì)象：飲水型、煤煙型、飲茶型中毒患者和動(dòng)物檢測樣品：全血或血清、紅細(xì)胞、肝、腦、腎、睪丸等觀察指標(biāo)：自由基水平、ROS水平、還原性物質(zhì)含量、抗氧化酶活性、 脂質(zhì)過氧化物水平、DNA損傷及細(xì)胞凋亡等驗(yàn)證試驗(yàn)：針對(duì)自由基與氧化應(yīng)激的阻斷或拮抗試驗(yàn)：Vit C、硒等抗氧化劑可拮抗氟化物引起的脂質(zhì)過氧化、DNA損傷、細(xì)胞凋亡等作用,氟中毒與細(xì)胞凋亡,在實(shí)

29、驗(yàn)條件下過量氟對(duì)多種組織細(xì)胞均有損害，但多數(shù)情況下并不造成壞死，也不伴有明顯的炎癥反應(yīng)，而多表現(xiàn)為實(shí)質(zhì)細(xì)胞固縮、核染色質(zhì)邊集等特征，與細(xì)胞凋亡的形態(tài)特點(diǎn)相吻合。因此，近年來國內(nèi)外對(duì)氟與細(xì)胞凋亡的關(guān)系是研究熱點(diǎn)。,用流式細(xì)胞術(shù)、病理形態(tài)學(xué)、原位末端標(biāo)記等多種手段證實(shí)，氟對(duì)體外的培養(yǎng)細(xì)胞（胰島β細(xì)胞、肺細(xì)胞、胸腺小葉、骨肉瘤細(xì)胞UMR106株、原代肝細(xì)胞，人胚肝細(xì)胞株等）和對(duì)整體動(dòng)物（大鼠、小鼠、綿羊、兔、豬等），均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。一

30、些凋亡基因如ICE、p53等mRNA和蛋白表達(dá)升高目前有關(guān)氟誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制不明,細(xì)胞凋亡的三條經(jīng)典途徑,NaF可使細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性增加，并存在劑量-效應(yīng)關(guān)系； NaF可使Fas ，F(xiàn)asL，Caspase-3，Caspase-8等基因的mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)；Fas受體激動(dòng)劑（CH11)單獨(dú)作用對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率，Caspase-3活性， Fas ，F(xiàn)asL，Caspase-3，Caspas

31、e-8基因mRNA表達(dá)沒有影響，但與高劑量NaF（40 μg/ml ）聯(lián)合作用后顯示出協(xié)同效應(yīng)。Fas受體激動(dòng)劑拮抗劑(ZB4)單獨(dú)作用對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率，Caspase-3活性， Fas ，F(xiàn)asL，Caspase-3，Caspase-8基因mRNA表達(dá)沒有影響，但可拮抗高劑量NaF（40μg/ml）的毒性作用，顯示出拮抗效應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)研究表明：Fas/FasL 系統(tǒng)在氟致細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信

32、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,NaF可使GRP78、IRE1、AFT6、CHOP等基因的mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)；應(yīng)用基因沉默或應(yīng)用桿菌肽、?；敲撗跄懰崾箖?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻滯或升高，從正向和反向兩方面探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及UPR信號(hào)通路在氟化物導(dǎo)致毒性中的作用。 實(shí)驗(yàn)研究表明：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在氟致細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用,需要進(jìn)一步探討的主要問題,特異性自由基升高與病變發(fā)生是平行關(guān)系還是因果關(guān)系難以證實(shí)是否是地氟病發(fā)生的基本機(jī)制或始動(dòng)環(huán)節(jié)能否排除其他

33、作用機(jī)制存在的可能性自由基增多和氧化應(yīng)激反應(yīng)與非骨相關(guān)系密切，但與骨相損害缺乏明確的相關(guān)性,氟中毒的環(huán)境基因組學(xué)研究,細(xì)胞的各種生理過程或病理改變從本質(zhì)上都是由基因表達(dá)的改變所決定的。因此，通過尋找基因表達(dá)的差異，進(jìn)而探討其在氟中毒中的作用，無疑具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用意義人類基因組計(jì)劃（human genome project, HGP）是由美國科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年由美國能源部(DOE)和國立健康研究院(

34、NIH)資助后正式啟動(dòng)環(huán)境基因組計(jì)劃（Environmental Genome Project ，EGP)啟動(dòng)于1997年，目標(biāo)是測序一組似乎與環(huán)境相關(guān)疾病有關(guān)的基因?？茖W(xué)家想確定這些基因在個(gè)體之間是如何變化，以及這些變化是否與疾病易感性有關(guān),易感基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的關(guān)系,生活在高氟地區(qū)的人群，并不是人人都患氟中毒高氟環(huán)境的作業(yè)人群，在接觸氟水平相同的情況下，也只是部分氟作業(yè)工人發(fā)生氟中毒盡管氟濃度是影響氟毒性的一個(gè)重要因

35、素，但似乎劑量水平不是唯一的影響因素研究證實(shí)，盡管個(gè)體攝入相同的氟，但氟斑牙和氟骨癥等氟毒性癥狀與性別、年齡和種族有關(guān),劉開泰教授的課題組，在飲水型氟中毒地區(qū)，隨機(jī)選取輕度和重度氟骨癥患者各10人，在水氟含量為0.6mg/L的地區(qū)選取10名健康人作為對(duì)照。采用美國Research Genetics公司的GF211基因芯片（每張膜含有4324個(gè)待檢cDNA）進(jìn)行檢測，經(jīng)Pathway3.0軟件分析發(fā)現(xiàn),氟骨癥患者與正常人基因表達(dá)結(jié)果,

36、與對(duì)照組相比，無論是輕度還是重度氟中毒患者，Ras-related GTP-binding protein（Ras蛋白）和transmembrane 9 superfamily member 1 （TM9SF，跨膜蛋白）兩個(gè)基因表達(dá)均呈現(xiàn)明顯上調(diào)，說明在疾病發(fā)生和發(fā)展過程中，這兩個(gè)基因持續(xù)高表達(dá)，同時(shí)有14個(gè)基因表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)，說明這些基因在高氟對(duì)人體損傷機(jī)制研究中也具有重要的作用。,正常兒童,氟斑牙兒童,高氟負(fù)荷兒童,,,,環(huán)境應(yīng)

37、答基因,耐受基因,易感基因,研究對(duì)象：10名氟斑牙患者，來自河南安陽飲水氟含量為1.1～2.0 mg/L的氟中毒病區(qū)。10名高氟負(fù)荷兒童（高氟地區(qū)無氟斑牙兒童），與氟斑牙患者來自同一病區(qū)。10名非病區(qū)正常兒童，來自河南安陽飲水氟含量為0.76 mg/L的地區(qū)。所有研究對(duì)象年齡均在8～14歲之間，且各組之間年齡、性別、營養(yǎng)狀況構(gòu)成比相同；采樣Affymetrix公司生產(chǎn)的寡核苷酸探針芯片HG-U133A，涵蓋18000多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表

38、了18000多個(gè)明晰基因，其中13000多個(gè)為全長基因；數(shù)據(jù)分析：用Affymetrix公司的GeneArray Scanner G2500A掃描芯片，芯片掃描所得的數(shù)據(jù)利用Affymetrix Microarray Suite software 5.0進(jìn)行處理和分析 。,兩兩芯片比較（差異分析）的結(jié)果,負(fù)荷/對(duì)照Robust變化基因聚類,轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因：ZFP36L2（Hs.78909），NR4A2（Hs.82120） EGR1

39、（Hs.326035），NR1D2（Hs.37288）等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因：IL1B（Hs.126256），RGS1（Hs.75256），CCL8（Hs.271387）等細(xì)胞趨化因子：CCL2（Hs.303649），CXCL2（Hs.75765）CXCL10（Hs.413924），IL8（Hs.624）等。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因：CIAS1（Hs.159483），IER3（Hs.76095），TNFAIP3（Hs.211600）等功能未

40、知基因：FLJ22002（Hs.461485）， IGHG1（Hs.413826）， IGLJ3（Hs102950），F(xiàn)LJ20265（Hs.7099）等,患者/對(duì)照Robust變化基因聚類,轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因：TP73L（Hs.137596），RUNX1（Hs.410074） ZFP36L2（Hs.78909）GAS7（Hs.226133）等功能未知基因：IGLJ3（Hs.102950 ）， LOC150759（Hs.446532）

41、， FLJ21144（Hs.59584），EIF4EBP3（Hs.406840）等,患者/負(fù)荷Robust變化基因聚類,轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因：CUTL2（Hs.407196），RUNX1（Hs.410774）， NR4A2（Hs82120），EGR1（Hs.326035）等。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因：IL1B（Hs.126256），CCL8（Hs.271387），RGS1（Hs.75256），CCL2（Hs.73817）等。趨化因子：CXCL3

42、（Hs.89690），CXCL2（Hs.75765），IL8（Hs.624），CXCL10（Hs.413924）等。代謝相關(guān)基因：ATP6V0E（Hs.440165），C200rf177（Hs.504920），USP9Y（Hs.371255），HPSE（Hs.44227）等。,結(jié)果顯示，氟化物的環(huán)境應(yīng)答基因除涉及轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因、癌基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因外，還包括結(jié)構(gòu)蛋白及運(yùn)輸?shù)鞍椎取?

43、 負(fù)荷組無論是與對(duì)照組，還是氟斑牙組比較，IL-1B、IL1RN、TNF等細(xì)胞因子表達(dá)均顯著上調(diào)，提示這些細(xì)胞因子可能與氟中毒耐受有關(guān)。 結(jié)論： 多種基因參與氟中毒的發(fā)生,李廣生教授所在的課題組，利用他們自己建立的永生化成骨細(xì)胞系（ROB-1：用含SV40T基因的質(zhì)粒pZIPSV40T轉(zhuǎn)染原代分離SD胎鼠顱骨成骨細(xì)胞后獲得）進(jìn)行2周的體外染毒（NaF劑量2mmol/L，相當(dāng)于38mg/L），采用DD-PC

44、R（差異反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)）技術(shù)比較分析發(fā)現(xiàn)，染氟細(xì)胞同對(duì)照細(xì)胞在基因表達(dá)方面存在明顯的差異。,T：NaF染毒成骨細(xì)胞；C：正常成骨細(xì)胞；箭頭所示為部分差異表達(dá)片斷,正常成骨細(xì)胞與NaF染毒細(xì)胞基因表達(dá)差異顯示圖譜,選擇部分表達(dá)差異明顯的片斷進(jìn)行克隆、測序，首先獲得了6個(gè)cDNA序列（Clone11, 39, 45, 47, 49,50），其長度介于500－700bp之間。通過國際互聯(lián)網(wǎng)以Blast軟件，將其與NCBI的NR文庫和ESTs

45、庫進(jìn)行同源性比較，獲知表中所示的結(jié)果。,該研究發(fā)現(xiàn)：在染氟成骨細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生改變的基因多與蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及加工有關(guān)，提示過量氟可能通過改變這些基因的表達(dá)而影響成骨細(xì)胞的蛋白的合成。新基因的全長序列及其功能還不清楚，有待進(jìn)一步研究。,氟中毒的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,在90年代，日本科學(xué)家就把氟中毒的大鼠肝進(jìn)行勻漿，用凝膠電泳的方法發(fā)現(xiàn)染氟大鼠肝勻漿出現(xiàn)一些新的蛋白條帶。,李廣生教授課題組，用高氟水（100 mg/L）喂養(yǎng)大鼠20周，取肝、腎、

46、血液提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行固相pH梯度－雙向凝膠電泳，用2-DE凝膠軟件分析投氟組與對(duì)照組總蛋白質(zhì)電泳銀染圖譜的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。再用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),氟中毒大鼠與正常對(duì)照蛋白多肽點(diǎn)分布,肝,腎,血液,染氟組的蛋白多肽點(diǎn)分布出現(xiàn)了一系列明顯改變,1. 投氟組與對(duì)照組相比，其肝、腎蛋白質(zhì)組在等電點(diǎn)pH酸性區(qū)蛋白質(zhì)多肽點(diǎn)的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組；腎、血液在pH堿性區(qū)蛋白多肽點(diǎn)的表達(dá)量

47、明顯低于對(duì)照組； 2. 發(fā)現(xiàn)共有32個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)（肝7個(gè)，腎14個(gè)，血液11個(gè)）只在投氟組檢出，而不見于對(duì)照組。這些蛋白質(zhì)點(diǎn)的性質(zhì)和功能，有待進(jìn)一步研究； 3. 投氟組腎檢測到的3個(gè)高表達(dá)的已知的酸性蛋白，利用蛋白質(zhì)組搜索引擎進(jìn)行檢索，初步判定斑點(diǎn)52可能為富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白即骨連蛋白；斑點(diǎn)83可能是神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白；斑點(diǎn)121可能為糖基化磷酸蛋白即骨橋蛋白。,

48、血清蛋白組學(xué),生物學(xué)標(biāo)志 biomarker,接觸生物學(xué)標(biāo)志（biomarker of exposure) 吸收劑量或靶劑量的指標(biāo)，提供關(guān)于接觸外源化學(xué)物的信息，可定量確定個(gè)體的接觸量。效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志（biomarker of effect) 機(jī)體中可測出的生化、生理、行為或其它改變的標(biāo)志，包括反映早期效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志、結(jié)構(gòu)和/或功能改變效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志及疾病效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志，提示與不同靶劑量

49、的外源化學(xué)物或其代謝物有關(guān)聯(lián)的對(duì)健康有害效應(yīng)的信息，可用于確定劑量-反應(yīng)關(guān)系和有助于在高劑量接觸下獲得的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料外推劑量接觸的危險(xiǎn)度。易感性生物學(xué)標(biāo)志（biomarker of susceptibility) 是關(guān)于個(gè)體對(duì)外源化學(xué)物的生物易感性的指標(biāo)，包括反映機(jī)體先天具有或后天獲得的對(duì)接觸外源性物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)能力的指標(biāo)，可鑒定篩選易感個(gè)體和易感人群，保護(hù)高危人群。,接觸生物學(xué)標(biāo)志（暴露標(biāo)志）-反映機(jī)體負(fù)荷水

50、平,血氟：血清或血漿（短期）尿氟：晨尿或全日尿（長期）毛發(fā)和指甲氟：長期骨氟（骨灰）：含量最高，接近體內(nèi)吸收氟一半,（1）  血氟,高氟地區(qū)人群血清氟含量均顯著高于對(duì)照組，有隨飲水氟含量增加而升高的趨勢，飲水氟含量相同的地區(qū)氟斑牙患者和高氟負(fù)荷人群血清氟含量無顯著性差異。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，血氟濃度與染氟濃度呈劑量－反應(yīng)關(guān)系。 但目前的觀點(diǎn)是：血氟水平的相對(duì)高低可以作為一種群體指

51、標(biāo)來反映環(huán)境氟暴露水平，不宜作為個(gè)體生物學(xué)標(biāo)志來反映機(jī)體氟損害。,主要是因?yàn)椋?1）人體對(duì)血氟存在自穩(wěn)調(diào)節(jié)機(jī)制，血氟水平并不太隨飲水氟含量增高而呈直線上升； 2）血氟水平受到實(shí)驗(yàn)條件、采樣時(shí)間及個(gè)體等多種因素的影響，在相同的水氟濃度下，不同實(shí)驗(yàn)室所測得的結(jié)果相差很大。如大多數(shù)研究者認(rèn)為，水氟與血氟大體是10:1的關(guān)系。但印度的資料顯示，飲水氟0.1mg/L時(shí)各家

52、所測得結(jié)果血氟與水氟至少相差3.5倍，1mg/L者至少相差4倍；國內(nèi)資料顯示，在相同水氟濃度下，各家所測得的結(jié)果最大值最下值相差5-15倍。如此大的差異，降低了血氟作為生物學(xué)標(biāo)志的應(yīng)用價(jià)值。,（2）尿氟,在飲水型地氟病區(qū)，尿氟與總攝氟量和水氟有顯著的相關(guān)關(guān)系，居民尿氟濃度與當(dāng)?shù)仫嬎鷿舛然鞠嗟?。病區(qū)與非病區(qū)群體尿氟含量的臨界值在兒童為1.4mg/L，成人為1.6mg/L。因此，尿氟含量不僅可作為群體指標(biāo)反映人群氟暴露水平，對(duì)于個(gè)體慢性

53、氟中毒的診斷也具有一點(diǎn)的參考價(jià)值。 在飲茶型氟中毒病區(qū)，人群調(diào)查研究，尿氟與病情之間存在矛盾現(xiàn)象，即無論尿氟均值，還是尿氟最高值，蒙古族兒童和成人的尿氟水平均高于藏族，但病情卻較輕，對(duì)過去用尿氟作為氟化物的暴露標(biāo)志物提出了質(zhì)疑問。,（3） 毛發(fā)、指甲中的氟,毛發(fā)和指甲含有少量氟，能反映機(jī)體氟蓄積狀況，故可作為慢性長期氟暴露的一種指標(biāo)。Elsair等在家兔氟中毒實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，家兔爪甲氟含量與骨氟水平之間有良好的平

54、行關(guān)系，而兔毛中的氟和骨氟則沒有這樣的關(guān)系。Levy等也通過大量的動(dòng)物試驗(yàn)和人群調(diào)查認(rèn)為：手和腳指甲做為飲食氟暴露的標(biāo)志物。但目前檢測指甲氟并未得到廣泛應(yīng)用。,（4）骨氟,骨氟含量無疑可反映機(jī)體內(nèi)氟蓄積狀況，可通過活檢取骨組織進(jìn)行檢測。但（1）取骨組織屬于有創(chuàng)傷性檢查不易被接受；（2）骨氟含量不僅取決于攝氟量，還與年齡、性別、骨的類型和部位等諸多因素有關(guān)，骨氟含量隨年齡的增長和攝氟量的增多而持續(xù)增加；（3）很難確定一個(gè)閾值，即骨氟蓄積量

55、超過多少就將發(fā)生氟中毒。,效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志,非骨相損害自由基與氧化應(yīng)激紅細(xì)胞：微粒體Na＋-K＋-ATP酶、膜脂質(zhì)含量、 膜巰基水平骨相損害堿性磷酸酶與骨鈣蛋白羥脯氨酸及其他膠原代謝產(chǎn)物,反映骨相損害的生物學(xué)標(biāo)志,（1） 堿性磷酸酶與骨鈣蛋白 AKP可視為成骨活動(dòng)的標(biāo)志酶。但慢性氟中毒患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物血清ALP的檢測結(jié)果也常常不太一致，這可能涉及多重因素，包括攝氟劑

56、量、時(shí)間、機(jī)體的營養(yǎng)狀態(tài)、骨病變的發(fā)展階段等。BGP是反映成骨細(xì)胞活動(dòng)和骨轉(zhuǎn)換的重要指標(biāo)。（2） 羥脯氨酸及其他膠原代謝產(chǎn)物 尿中HOP含量可反映骨代謝的改變。無論破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞加強(qiáng)都會(huì)伴有尿HOP排出增多。 一些反映膠原代謝的標(biāo)志物，如血清中I型前膠原羧基端前肽（PICP）、尿中I型膠原交聯(lián)N末端肽（NTX）、膠原脫氧吡啶交聯(lián)（DPD）等，尚未見在地氟病中應(yīng)用。（3） 甲狀旁

57、腺激素 血清PTH升高可能是氟骨癥的一個(gè)普通發(fā)病環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為，如果患者血清PTH增高，則是氟骨癥病變進(jìn)展特別是向骨質(zhì)疏松、骨轉(zhuǎn)化方向發(fā)展的重要信號(hào)。,反映非骨相損害的生物學(xué)標(biāo)志,（1）指標(biāo)的非特異性 比如與氧化應(yīng)激有關(guān)的指標(biāo)，包括自由基產(chǎn)生增多、抗氧化酶活性下降、脂質(zhì)過氧化物水平升高等，確實(shí)可在地氟病患者或氟中毒試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)檢測出來；氧化應(yīng)激與氟的非骨相損害也確有一定聯(lián)系。但能引起機(jī)體

58、氧化應(yīng)激反應(yīng)的原因很多，伴有自由基代謝混亂和抗氧化能力下降的疾病或病理狀態(tài)很多。（2）指標(biāo)的不確定性 如反應(yīng)肝、腎等功能損害的一些指標(biāo)的不一致。（3）指標(biāo)的雙向性 氟對(duì)酶系統(tǒng)的影響或?qū)w外培養(yǎng)細(xì)胞的作用常表現(xiàn)為雙向性，即隨著氟從低濃度到高濃度，其生物學(xué)效應(yīng)由促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制。如在血清氟濃度時(shí)（約10µmol/L即0.18mg/L），對(duì)一些酶表現(xiàn)為穩(wěn)定或激活作用；血清氟濃度高時(shí)（至

59、少0.3mg/L），則對(duì)許多酶表現(xiàn)為抑制作用。,有待深入研究的問題,1）氟作用的靶器官、靶組織、靶細(xì)胞、靶分子是一個(gè)需要繼續(xù)深入研究的問題。直到現(xiàn)在，除了牙齒和骨骼（包括骨內(nèi)和骨周膠原纖維）之外，是否還有其他對(duì)氟有特殊反應(yīng)的靶組織或靶器官，仍缺乏肯定的、普遍認(rèn)同的結(jié)論。 2）骨相組織與非骨相組織對(duì)氟的毒性反應(yīng)誰更敏感？,有待深入研究的問題,3） 氟中毒有無特異性表達(dá)基因或特殊的蛋白表達(dá)。 4）