生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)期末蠶豆病設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、年級(jí)：xxxx級(jí) 專業(yè)：xxx 班級(jí)：xxx,設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)報(bào)告,第x實(shí)驗(yàn)室 第x組,時(shí)間：xxxx年xx月xx日星期x,報(bào)告人：xxx,組員：xxx,xxx,xxx,xxx,xxx,xxx,xxx,xxx,xxx,xxx,案例分析,案例分析,案例： 患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣（發(fā)生溶血性貧血）色，面色蒼白。據(jù)家長(zhǎng)反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過(guò)類似情況。

2、 體格檢查：體溫38℃，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏c膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無(wú)叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞 1.98×1012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5µmol/L，結(jié)合膽紅素13.7µmol/L，未結(jié)合膽紅素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潛

3、血(+)，尿膽紅素(－)，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見(jiàn)紅細(xì)胞。,,,,紅細(xì)胞 1.98×1012/L （6.0-7.0）×1012/L ↓ 血紅蛋白 53g/L （170-200)g/L ↓ 血清總膽紅素 85.5µmo

4、l/L （3.4-17.1）µmol/L ↑ 結(jié)合膽紅素 13.7µmol/L 0～3.42μmol/L ↑ 未結(jié)合膽紅素 71.8µmol/L 0～13.68μmol/L ↑ 尿蛋白（++） 潛血(+) 尿膽紅素(－) 尿膽素原(+),實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目,正

5、常值,患兒檢查值,案例分析,體溫升高,B:40bpm呼吸急促,蠶豆病,紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥[1],案例分析,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),,,G6PD基因分析,G6PD確診試驗(yàn),紅細(xì)胞G6PD活性測(cè)定,G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn),G6PD篩選試驗(yàn),高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn),特異性不高,國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),,G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)[2],,,G6PD,實(shí)驗(yàn)原理：葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（

6、6PGA）,同時(shí)使NADP轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH,后者在340nm波長(zhǎng)紫外線照射下產(chǎn)生熒光。所以將含有G6P和NADP等的混合試劑與血混勻，通過(guò)觀察濾紙上有熒光出現(xiàn)時(shí)間可判斷G6PD活性。,NADP NADPH,G6P 6PGA,,實(shí)驗(yàn)原理,,340nm紫外線,熒光,試劑：10mmol/L G6

7、P鈉鹽、7.5mmol/L NADP、1g/dL皂素、250mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4），蒸餾水,儀器：長(zhǎng)波紫外燈、濾紙、水浴箱,G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn),,實(shí)驗(yàn)流程,G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn),1反應(yīng)液的配制：10mmol/l G6P鈉鹽0.1ml、7.5mmol/l NADP0.1ml、1g/dl皂素0.2ml、250mmol/l磷酸鹽緩沖液（pH7.4）0.3ml，蒸餾水0.3ml混勻。其中除皂素外，均可于4℃下保存半月，皂

8、素必須新鮮配制。反應(yīng)混合液在室溫和冰箱中均不易保存。因此最好在臨用前根據(jù)用量臨時(shí)混合。,,3.取試管，加10μl全血+100μl反應(yīng)液，混勻，取一滴于濾紙上（第一斑點(diǎn) ）→作為對(duì)照；,2.將上液置于37℃水浴10min ，再取一小滴滴于濾紙上（第二斑點(diǎn)）→實(shí)驗(yàn)組 ；,4.晾干后，于長(zhǎng)波紫外燈下（365nm）觀察結(jié)果并計(jì)時(shí) 。,實(shí)驗(yàn)流程,G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn),正常人： 0min斑點(diǎn)無(wú)熒光，5-10min出現(xiàn)，

9、 10min熒光最強(qiáng) 臨床診斷： 輕度缺陷者：0-10min熒光很弱或不出現(xiàn) 中度缺陷者：10-30min出現(xiàn)熒光 嚴(yán)重缺陷者：30min內(nèi)不出現(xiàn)熒光,結(jié)果分析,G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn),,紅細(xì)胞G6PD活性測(cè)定,實(shí)驗(yàn)原理：基本原理同G6PD熒光斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。不同的是利用紫外光分光光度法定量測(cè)定酶活性，即每隔一分鐘在340nm波長(zhǎng)測(cè)定孵育液中NADPH吸光度（測(cè)6次），求每分鐘吸光度增加

10、的平均值，根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)NADPH生成由于所用試劑及體系的不同。方法：①WHO推薦的Zinkham;②NBT定量法等,實(shí)驗(yàn)原理,G-6-PD活性測(cè)定的操作表（Zinkham法 ),試管 對(duì)照管 測(cè)定管,NADP液（ml） 0.1 0.1Tris液（ml） 0.1

11、 0.1氯化鎂液（ml） 0.1 0.1蒸餾水（ml） 0.68 0.58G6P液（ml） — 0.1 37℃預(yù)熱溶血液（μl）

12、 20 20,,,,,,,立即340nm處測(cè)吸光度，以對(duì)照管調(diào)零，37℃恒溫，每分鐘觀察1次，記錄吸光度的變化,實(shí)驗(yàn)流程,紅細(xì)胞G6PD活性測(cè)定,計(jì)算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =△A/min×1000/6.22×1020/20× Hb(gL-1),△A/min:每min吸光度的平均變化值1000/6.22:為微摩爾消光系數(shù)1020/20

13、:總?cè)萘颗c溶血液的量之比；,實(shí)驗(yàn)流程,紅細(xì)胞G6PD活性測(cè)定,G6PD缺陷者：G6PD活性較正常平均值低40%以上即可作出診斷,方法 正常值范圍,,WHO推薦的Zinkham (12.01±2.09)IU/gHb(37℃)ICSH推薦的Glock與McLoan法 （8.34±1.59）IU/gHb(37℃)NBT定量法

14、 （13.1~30.0）NBT單位Chapman和Dern法 （2.8~7.31）IU/gHb(25℃),,,,結(jié)果分析,紅細(xì)胞G6PD活性測(cè)定,從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果[3],,,GSH的主要作用：① 保護(hù)紅細(xì)胞內(nèi)的含硫氫基 （-SH）血紅蛋白、酶蛋白和膜

15、 蛋白的完整性，免遭氧化 ② 與谷胱甘肽過(guò)氧化酶共同使 H2O2還原成H2O,→紅細(xì)胞 膜破裂,→溶血性貧血 （面色蒼白）,→游離Hb>腎 吸收閾值,→血紅蛋白尿/ 含鐵血黃素尿,G6PD↓,→NADPH+H+↓,→GSH↓,→紅細(xì)胞的抗氧化能力↓,血尿、醬油樣尿液,皮

16、膚及鞏膜黃染,,,,紅細(xì)胞 1.98×1012/L （6.0-7.0）×1012/L ↓ 血紅蛋白 53g/L （170-200)g/L ↓ 血清總膽紅素 85.5µmol/L （3.4-17.1）µ

17、mol/L ↑ 結(jié)合膽紅素 13.7µmol/L 0～3.42μmol/L ↑ 未結(jié)合膽紅素 71.8µmol/L 0～13.68μmol/L ↑ 尿蛋白（++） 潛血(+) 尿膽紅素(－) 尿膽素原(+),實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目,正常值,患兒檢查值,案例分析,體溫升高,導(dǎo)致患兒體溫

18、升高,,具有載氧能力的Hb含量下降,呼吸急促,討該病發(fā)生的分子基礎(chǔ)，可以用哪些技術(shù)檢測(cè)什么目的基因 ？[4],檢測(cè)G6PD基因,,,此外還可以用通過(guò)擴(kuò)增葡G6PD基因第10，11，12，13外顯子639bpDNA片段結(jié)合寡核苷酸探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)、PCR/SSCP分析法、DNA序列分析、探針技術(shù)等方法檢測(cè)上述基因的點(diǎn)突變。,體型瘦小與該病癥的相關(guān)性,營(yíng),養(yǎng),物,質(zhì),運(yùn),輸,不,足,相關(guān),參考文獻(xiàn),[1]紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏