第四章無菌技術

1、第四章,發(fā)酵工業(yè)的無菌技術,本章內容,一、相關概念 二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略三、發(fā)酵工業(yè)的無菌技術四、培養(yǎng)基及設備滅菌 五、空氣除菌,一、相關概念:滅菌、消毒、除菌、防腐,滅菌(sterilization):用化學或物理方法殺死物料或設備中所有有生命物質的過程。 消毒(disinfection):用物理或化學方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用過濾方法除去空氣或

2、液體中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化學方法殺死或抑制微生物的生長和繁殖 。,,消毒和滅菌的區(qū)別 1消毒僅僅是殺滅生物體或非生物體表面的微生物，而滅菌是殺滅所有的生命體。2消毒一般只能殺死營養(yǎng)細胞，而不能殺死細菌芽孢和真菌孢子等，特別適合于發(fā)酵車間的環(huán)境和發(fā)酵設備、器具的無菌處理。,二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略,（一）污染的危害（二）污染的防治,1.染菌的不良后果,①由于雜菌污染，使發(fā)酵培

3、養(yǎng)基因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降；②雜菌合成一些新的代謝產(chǎn)物，或雜菌污染后改變了發(fā)酵液的某些理化性質，使發(fā)酵產(chǎn)物的提取和分離變得困難，造成產(chǎn)物收率降低或產(chǎn)品質量下降；③雜菌代謝會改變原反應體系的pH值，使發(fā)酵發(fā)生異常變化；④雜菌分解產(chǎn)物，使生產(chǎn)失?。虎菁毦l(fā)生噬菌體污染，微生物細胞被裂解，導致整個發(fā)酵失敗等。,2.染菌危害的具體分析（1）染菌對不同菌種發(fā)酵的影響,A．細菌發(fā)酵周期較短，主要防止噬菌體污染。B. 霉

4、菌周期較長，產(chǎn)物類型各不相同。C. 酵母菌:易污染細菌以及野生酵母菌污染。 D. 疫苗無論污染的是活菌、死菌或內外毒素，都應全部廢棄。,（2）不同發(fā)酵時期染菌對發(fā)酵的影響,種子擴大時期染菌:發(fā)酵前期染菌：發(fā)酵中期染菌：挽救困難，應早發(fā)現(xiàn)，快處理，處理方法應根據(jù)各種發(fā)酵的特點和具體情況來決定。 抗生素發(fā)酵 檸檬酸發(fā)酵 a. 污染細菌：加大通風，加速產(chǎn)酸，調pH3.0，抑制細菌 b. 污染酵母：加入0

5、.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通風加大，加速產(chǎn)酸。,滅菌后棄去.,應迅速重新滅菌，補充必要的營養(yǎng)成分，重新接種.,（2）不同發(fā)酵時期染菌對發(fā)酵的影響,c.染黃曲霉：加入另一罐將近發(fā)酵成熟的醪液，pH下降，黃曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能夠生長。提前放罐。發(fā)酵后期污染染菌量不太多，可繼續(xù)發(fā)酵污染嚴重，則提前放罐,（3）雜菌污染對發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質量的影響,絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：pH不斷下降，菌絲

6、大量自溶，發(fā)酵液粘度增加，過濾困難 處理方法：①將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑；②先加絮凝劑使蛋白質凝聚后沉淀,（二）污染的防治1. 染菌的檢查與判斷,顯微鏡檢查法 鏡檢出雜菌需要一定時間，數(shù)量要求平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法：菌落，時間8h以上 噬菌體檢查可采用雙層平板法：噬菌斑（12-20h）肉湯培養(yǎng)檢查法（37℃，27℃） 發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象判斷DO2水平異常變化pH異常變化尾氣CO2異

7、常變化,1,2,2. 污染原因分析,主要原因： ①種子帶菌 ②無菌空氣帶菌 ③設備滲漏 ④滅菌不徹底 ⑤操作失誤 ⑥技術管理不善,從污染時間看：早期污染可能與①②④⑤→接種操作不當有關；后期污染可能與③⑤及中間補料有關。從雜菌種類看：耐熱芽孢桿菌：與④有關球菌、無芽孢桿菌：與①②③⑤有關淺綠色菌落的雜菌：與水有關，即冷卻盤管滲漏霉菌：與④⑤有關，即無菌室滅菌不徹底或操作問題酵母菌：

8、糖液滅菌不徹底或放置時間較長 從染菌幅度看：各個發(fā)酵罐或多數(shù)發(fā)酵罐染菌，且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問題，若個別罐連續(xù)染菌，一般是設備問題。,2. 污染原因分析,3. 預防,種子帶菌的防治 滅菌徹底接種可靠：無菌室及設備可靠，無菌操作可靠保藏可靠過濾空氣帶菌的防治設備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治,“死角”,發(fā)酵罐的“死角” 法蘭、內襯、接口、表頭、罐內部件及其支撐件如攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤管、擋板

9、、空氣分布管及其支撐件 口：人孔（或手孔）、排風管接口、燈孔、視鏡口、進料管口 發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角” 消除方法：加強清洗并定期鏟除污垢；安裝放汽邊閥管道安裝不當或配置不合理形成的“死角”,,發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角”,法蘭連接不當造成的“死角”,滅菌時蒸汽不易通達的“死角”及其消除方法,培養(yǎng)基與設備滅菌不徹底的防治原料性狀：大顆粒的原料過篩除去。 實罐滅菌時要充分排除罐內冷空氣。滅菌過

10、程中產(chǎn)生的泡沫造成染菌：添加消泡劑 防止泡沫升頂連消不徹底（時間、強度）：最好采用自動控制裝置 滅菌后期罐壓驟變 死角 操作不當造成染菌 噬菌體染菌及其防治,3. 預防,采取哪些措施能夠保持無菌發(fā)酵？,物料、培養(yǎng)基、中間補料要滅菌；發(fā)酵設備及輔助設備（空氣過濾裝置、各種發(fā)酵罐進出口連接裝置）和管道要滅菌；好氣發(fā)酵通入的空氣要除菌；種子無污染；接種無菌操作過關；為了保持發(fā)酵的長期無菌狀態(tài)，需維持正壓。,三、發(fā)酵工業(yè)

11、的無菌技術——滅菌方法,干熱滅菌法（160-170℃ 1-2h） 濕熱滅菌法 射線滅菌法（細菌芽孢和霉菌孢子不可以，穿透力不強） 化學藥劑滅菌法（環(huán)境消毒）過濾除菌法火焰滅菌法,四、培養(yǎng)基及設備滅菌,（一）濕熱滅菌原理 （二）分批滅菌（實罐滅菌） （三）連續(xù)滅菌（連消）（四）分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,1. 熱阻2. 微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律3. 滅菌溫度和時間的選擇 4. 影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素,（一）濕熱滅

12、菌原理,1. 熱阻,微生物對熱的抵抗力稱為熱阻。熱死時間：在規(guī)定的溫度下殺死一定比例微生物所需要的時間。衡量滅菌徹底與否，是以能否殺滅芽孢細菌為標準。,2. 微生物熱死定律：(1) 對數(shù)殘留定律,在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應速度理論，微生物受熱死亡的速率-dN/dt與任何瞬間殘留的活菌數(shù)N成正比，即

13、 t=2.303(lgN0/Nt)/k 當Nt=0時， t=∞， 既無意義，也不可能。 一般采用Nt=0.001，即1000次滅菌中只有一次失敗。,,,,,,大腸桿菌在不同溫度下的殘留曲線(斜率的絕對值為k),嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線,(2) 非對數(shù)殘留定律,某些微生物受熱死亡的速率不符合對數(shù)殘留定律：如一些微生物芽孢。 kR ks

14、NR Ns NDdNR/dt=-kR NRdNs/dt =kR NR -ks Ns →Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt] 式中NR：耐熱性活芽孢數(shù)；Ns：敏感性活芽孢數(shù) ND：死亡的芽孢數(shù)；kR：耐熱性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢數(shù)。,,,,3

15、. 滅菌溫度和時間的選擇,培養(yǎng)物質受熱破壞也可看作一級反應：式中C：對熱不穩(wěn)定物質的濃度；k’：分解速度常數(shù)； k’的變化也遵循阿累尼烏斯方程：,,都與相應的活化能及T有關,,,,當T1 →T2 ㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’) ∴隨著T上升，菌死亡速率增加倍數(shù)大于培養(yǎng)基成分分解速率增加倍數(shù)，故一般選擇高溫快速滅菌 。,3. 滅菌溫度和時間的選擇,4. 影響培養(yǎng)基

16、滅菌的其它因素,培養(yǎng)基成分油脂、糖類及一定濃度的蛋白質、高濃度有機物等增加微生物的耐熱性低濃度（1%-2%）NaCl對微生物有保護作用，隨著濃度增加，保護作用減弱，當濃度達8%-10%以上，則減弱微生物的耐熱性。,pH：pH6.0-8.0，微生物最耐熱，pH<6.0，H+易滲入微生物細胞內，改變細胞的生理反應促使其死亡?！嗯囵B(yǎng)基pH愈低，滅菌所需時間愈短。培養(yǎng)基的物理狀態(tài)泡沫：泡沫中的空氣形成隔熱層，對滅菌極為不利，可加入

17、少量消泡劑 。培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量,4. 影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素,空氣過濾器滅菌并用空氣吹干,夾套或蛇管排冷水，開啟排氣管閥，空氣管通蒸汽，也可夾套內通蒸汽,,,達70℃左右,取樣管,放料管,,通蒸汽,120℃，1×105pa,,保溫,保溫階段，凡液面以下各管道都應通蒸汽，液面上其余各管道則應排蒸汽，不留死角，維持壓力、溫度恒定,,罐壓接近空氣壓力,,向罐內通無菌空氣,,保溫結束，依次關閉各排汽、進汽閥門,,夾套或蛇管中

18、通冷水 培養(yǎng)基降溫到所需溫度,（二）分批滅菌（實罐滅菌） 1.滅菌工藝過程,,升溫、冷卻兩階段也有一定的滅菌效果，考慮到滅菌的可靠性主要在保溫階段進行，故可以簡單地利用式 ㏑(N/N0) =-kt 來粗略估算滅菌所需時間。,2. 滅菌時間的估算,2. 滅菌時間的估算,例1：有一發(fā)酵罐內裝40m3培養(yǎng)基，在1210C溫度下實罐滅菌，原污染程度為每1ml有2×105個耐熱細菌芽孢，已知1210C時滅菌速度常數(shù)

19、k=1.8min-1，求滅菌失敗機率為0.001時所需時間。 解：N0=40×106×2×105=8×1012(個) Nt=0.001(個) k=1.8(min-1) ㏑(Nt/N0)=-kt t=2.303[lg(N0/Nt)]/k=2.303[lg(8×1015)]/k=20.34(min)

20、 由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當培 養(yǎng)基加熱至1000C以上，這個作用較為顯著， 故實際保溫階段時間比計算值要短。,（三）連續(xù)滅菌（連消）,工藝流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程噴射加熱連續(xù)滅菌流程 薄板式換熱器連續(xù)滅菌流程 滅菌時間的計算 ㏑(Nt/N0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：N0、Nt分別為單位體積培養(yǎng)基滅菌前、后

21、 的含菌數(shù)。,,噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程,分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,連續(xù)滅菌的優(yōu)點：（適用于大型罐） 可采用高溫短時滅菌，營養(yǎng)成分破壞少，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)率；發(fā)酵罐利用率高； 蒸汽負荷均衡； 采用板式換熱器時，可節(jié)約大量能量；適宜采用自動控制，勞動強度小；可實現(xiàn)將耐熱性物料和不耐熱性物料在不同溫度下分開滅菌，減少營養(yǎng)成分的破壞。,缺點：對小型罐無優(yōu)勢，不方便，對設備要求高；蒸汽波動時滅菌不徹底；當培養(yǎng)基中含有固體顆粒或有較

22、多泡沫時，以分批滅菌好，防止滅菌不徹底。,分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,五、空氣除菌,（一）概述（二）空氣過濾除菌流程（三）空氣預處理（四）空氣預處理流程設計應用舉例（五）空氣過濾介質（六）空氣過濾除菌原理（七）提高過濾除菌效率的措施,（一）概述,空氣除菌的必要性 以一個50m3的發(fā)酵罐為例，若裝料系數(shù)為0.7，要求每立方米發(fā)酵液每分鐘通氣0.8m3，培養(yǎng)周期170h，那么每個周期需通氣量2.86×105

23、m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60)，而每立方米大氣中約有103-104個微生物。,空氣除菌方法輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，x射線、β射線、γ射線、紫外線(2265Å ~3287 Å)加熱殺菌：加熱方法可用蒸汽、電和空氣壓縮機產(chǎn)生的熱量 靜電除菌 ：常用于潔凈工作臺、潔凈工作室所需無菌無塵空氣的第一次除塵，配合高效過濾器使用。過濾除菌：采用定期滅菌

24、的介質來阻截流過的空氣所含的微生物而取得無菌空氣。常用的過濾介質有棉花、活性炭、玻璃纖維、有機合成纖維、有機和無機燒結材料等等。,（一）概述,1. 對空氣過濾除菌流程的要求,流程主要設備：空氣壓縮機 、空氣過濾器 附屬設備：粗過濾器、氣液分離器、空氣貯罐、空氣冷卻器,流程的制定應根據(jù)所在地的地理、氣候環(huán)境和設備條件綜合考慮 環(huán)境污染比較嚴重的地方，要考慮改變吸風的條件；在溫暖潮濕的南方，要加強除水設施 ；壓縮機耗油嚴重的

25、設備流程中則要加強消除油霧的污染 ，也可采用無油潤滑的往復式壓縮機；往復式壓縮機，要配備前置粗過濾器及空氣貯罐。通常要求壓縮空氣的相對濕度Φ=50%~60%時通過過濾器為好。,1. 對空氣過濾除菌流程的要求,2. 空氣除菌流程的分析,空氣除菌系統(tǒng)包括：冷卻、分離油水、加熱、 過濾典型的設備流程 兩級冷卻、加熱除菌流程 高效前置過濾空氣除菌流程利用熱空氣加熱冷空氣流程一次冷卻和析水的空氣過濾流程,（三

26、）空氣預處理,1. 原理：除塵(外源空氣的前處理)：防塞，提高過濾效率和濾器壽命；降溫：防燒傷介質及水分蒸發(fā)嚴重，對發(fā)酵不利除油、除水：防塞（因油膜堵），防止過濾器長菌堵塞（因水滴）加熱：保持相對濕度穩(wěn)壓：防止壓力波動，貯罐 2. 預處理流程設計的簡繁關鍵：去濕問題,措施：建吸風塔、粗過濾器（布袋過濾器、,填料過濾器和水霧除塵裝置等）、高效前置過濾器,兩級冷卻、加熱除菌流程圖1-粗過濾器；2-空壓機；3-貯罐

27、；4，6-冷卻器；5-旋風分離器；7-絲網(wǎng)分離器；8-加熱器；9-過濾器,,利用熱空氣加熱冷空氣的流程示意圖1-高空采風；2-粗過濾器；3-壓縮機；4-熱交換器；5-冷卻器；6，7-析水器；8-空氣總過濾器；9-空氣分過濾器,高效前置過濾空氣除菌流程圖1—高效前置過濾器；2—壓縮機；3—貯罐；4—冷卻器；5—絲網(wǎng)分離器；6—加熱器；7—過濾器,空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻,空氣的壓縮過程可看作絕熱過程，故壓縮后的空氣溫度與被壓縮的程度

28、有關： T2=T1(P2/P1)(k-1)/k 式中 T1,T2——壓縮前后空氣的絕對溫度，K P1,P2—— 壓縮前后空氣的絕對壓強，Pa k——絕熱指數(shù)，空氣為1.4 若壓縮為多變過程，則可用多變指數(shù)m（對于 空氣m=1.2-1.3）代替絕熱指數(shù)k。,例2：20oC的大氣被壓縮至表壓 2.5kg/cm2時

29、溫度是多少？ 解：T1=20+273=293k P2/P1=（2.5+1.033）/1.033=3.42 m=1.3 T2=T1(P2/P1)(m-1)/m=293×3.420.3/1.3=389k ∴t2=389-273=116oC,空氣預處理流程設計,3. 幾個概念,空氣的絕對濕度：1m3 濕空氣中含有的水蒸氣絕對量(kg)

30、空氣的相對濕度（Φ）：空氣的絕對濕度與同溫度下飽 和絕對濕度之比值或者空氣中水蒸汽分壓與同溫度時的 飽和水蒸汽壓之比值，稱為空氣的相對濕度。 Φ=Pw/Ps 式中 Pw——空氣中水蒸氣分壓， Pa Ps——同溫度下水的飽和蒸氣壓，Pa， 它可由各類手 冊中查到?？諝獾臐窈浚╔）：1kg干空氣中含有的水汽量

31、 （kg/kg干空氣）,空氣的濕含量（X）,設Gg kg干空氣中含Gw kg水蒸汽時，則 X=Gw/Gg 又Pw/Pg=nw/ng=(Gw/Mw)/(Gg/Mg) =(Gw/Gg)·(Mg/Mw) （Mw，Mg分別為水和空氣的分子量）

32、 ∴X=Gw/Gg=(PwMw)/(PgMg)=(18/28.94)·(Pw/Pg) =0.622Pw/(P-Pw) （4-1）,（1）Φ與X的關系,將ΦPs=Pw代入式4-1中得 X=0.622ΦPs/（P-ΦPs）所以，已知某一溫度T時Φ值，便可求得X。 ①當X一定時，T1→T2，導致Φ1→Φ2 ，則X1=0.622Φ1Ps1/(P1-

33、Φ1Ps1)X2=0.622Φ2Ps2/(P2-Φ2Ps2)∵X1=X2 ∴Φ2=Φ1(PS1/PS2)(P2/P1) （式4-2）,②當X發(fā)生變化，即有水析出時，X降低，此時Φ2=100%， 定義：當Ф=1時，空氣中水蒸氣已飽和，此時溫度稱為露點Td。當T<Td時，有水析出，X ↓ 。,（1）Φ與X的關系,思考題,壓縮空氣的露點比原始空氣的露點更高，即更易析出水分，為什么壓縮比愈大，露點愈高？,,思

34、考題答案：由 可知當 ＝1時，求出 Ps2 對應 TdPs2 愈高， Td 愈高 而∴壓縮空氣的露點 比原始空氣 高( P2>P1) 壓縮比 愈大，露點愈高,加熱后空氣的溫度,設析出水后，在升溫階段ΔX=0，根據(jù)式4-2可以求出

35、析水后應升溫到多少度才能滿足相對濕度保持50-60%。 ∵ Φ后= ΦdPsd/Ps后 ∴ Ps后= ΦdPsd/ Φ后 Ps后→T后,例3：溫度20℃、Φ=85%的空氣，當壓縮至2.0kg/cm2時，溫度為120℃，求此時空氣相對濕度是多少？若在壓力不變的情況下將溫度冷卻至40℃后，相對濕度又是多少？ 已知：20℃時，Ps1=0.0238 kg/cm2,120℃時，Ps2=

36、2.025 kg/cm2 ，40℃時，Ps3=0.0752 kg/cm2,解：120℃時，相對濕度為 40℃時，相對濕度為,,,例4：若將例4中空氣繼續(xù)冷卻，至水析出，求露點td？（假定壓力不變）,解：已知Φ4＝100%，X一定，P一定由所以查蒸汽壓表，0.059 kg/cm2飽和蒸汽壓對應溫度td＝35℃。所以，當t<35℃，繼續(xù)冷卻時，有水析出。,,,例5：若將例4中的空氣冷卻至28℃（

37、壓力不變），求其濕含量為多少？并求每公斤干空氣將析出多少水分？（已知：28℃時，Ps5＝0.0385 kg/cm2）,,解： 而最初 所以，每公斤干空氣將析出水分： ΔX＝X1-X5＝0.0124-0.0080＝0.0044㎏水,,,例6：若將例5中空氣加熱至38 ℃時，求其Φ6？ （38 ℃時，Ps6＝0.0675 kg/cm2）,,解：升溫時X不變，Φ5→

38、Φ6時Φ值下降 也可根據(jù)X6＝X5＝0.0080 不變，由 得,,,,,（五）空氣過濾介質,棉花玻璃纖維活性炭 超細玻璃纖維紙 石棉濾板 燒結材料過濾介質 新型過濾介質,（六）提高過濾除菌效率的措施,減少進口空氣的含菌數(shù)量，主要方法：正確選擇進風口；提高進口空氣的采氣位置；采用粗過濾預處理。 設計和安裝合理的空氣過濾器，

39、選用除菌效率高的過濾介質。針對不同地區(qū)，設計合理的空氣預處理工藝流程，以達到除油、水和雜質的目的 。,降低進入空氣過濾器的空氣相對濕度，保證過濾介質能在干燥狀態(tài)下工作，主要方法：使用無油潤滑的空氣壓縮機；加強空氣冷卻和去除油、水；提高進入過濾器的空氣溫度。穩(wěn)定壓縮空氣的壓力，采用合適容量的貯氣罐。,（七）提高過濾除菌效率的措施,本章小結,掌握有關無菌技術的基本概念了解發(fā)酵工業(yè)污染的原因及其防治策略掌握培養(yǎng)基及設備滅菌的基本原理、