第十二章核素示蹤原理及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、1,第十二章核素示蹤原理及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),第一節(jié)、核素示蹤原理,2,一、核素示蹤原理及應(yīng)用（ Tracer Experiments ),1.核素示蹤法: 利用核素作為示蹤劑（tracer)而建立起來(lái)的一種微量研究方法，用于觀察物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化。,3,要點(diǎn)：一般示蹤實(shí)驗(yàn)均采用核素極其標(biāo)記物作示蹤劑，所以一般認(rèn)為的示蹤實(shí)驗(yàn)是指核素示蹤實(shí)驗(yàn),,,觀察對(duì)象：元素、 化合物、細(xì)胞、寄生蟲(chóng),,,加上標(biāo)記：Labeling,,引入到待研究系統(tǒng)（整體、離體細(xì)胞

2、、無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)）,,觀察該標(biāo)記物的去向（部位、數(shù)量、時(shí)相）,,了解被標(biāo)記物的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)化規(guī)律：吸收、分布、排泄、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝,4,原理：兩個(gè)基本點(diǎn),核素（放射性與穩(wěn)定核素）極其標(biāo)記物雖與自然界存在的相對(duì)應(yīng)的同位素和化合物的物理性質(zhì)不同，卻具有相同的化學(xué)性質(zhì)和生物特性。進(jìn)入機(jī)體后,在機(jī)體內(nèi)所發(fā)生的化學(xué)變化或生物學(xué)過(guò)程與被示蹤的物質(zhì)相同。,放射性核素—衰變—射線---測(cè)出穩(wěn)定性核素---質(zhì)量不同---質(zhì)量分析器---檢出,5,3. 應(yīng)用及意義：

3、,核素示蹤廣泛用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)和計(jì)劃生育等等各方面。,6,4.示蹤法的特點(diǎn),核素作為標(biāo)記的特點(diǎn)：示蹤工作對(duì)標(biāo)記基本要求為：制成的標(biāo)記物必須與被示蹤對(duì)象有相同的生物學(xué)行為-----代表性+本身的特征-----易檢測(cè)到標(biāo)記,化學(xué)基團(tuán)熒光基團(tuán)酶分子,,有各自的特點(diǎn)與用途,但對(duì)于示蹤實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)（體內(nèi)）---會(huì)對(duì)原分子造成較大的分子結(jié)構(gòu)上的變化-------導(dǎo)致結(jié)論的不可靠,7,可選用核素進(jìn)行示蹤實(shí)驗(yàn)，特點(diǎn)

4、：,靈敏度高----10-14-10-18g水平，（化學(xué)： 10-12水平，對(duì)微量物質(zhì)的定量分析有特殊價(jià)值。測(cè)量方便----衰變不受外力影響，不受雜質(zhì)干擾，不用提純待測(cè)物----可直接測(cè)量。合于生理?xiàng)l件----示蹤物劑量可以是生理水平，不干擾破壞機(jī)體的生理平衡。可以定位---- 器官、細(xì)胞、亞細(xì)胞水平。,8,穩(wěn)定核素示蹤的特點(diǎn),無(wú)輻射危害不衰變、不分解無(wú)化學(xué)毒對(duì)標(biāo)記原子的位置及結(jié)構(gòu)可以定位及分析缺點(diǎn)：操作人員的培訓(xùn)、儀器的

5、昂貴、同位素效應(yīng)。,9,二、示蹤劑tracer,是一些有特殊標(biāo)記的、很容易被測(cè)定的核素及其化合物。分為：放射性和穩(wěn)定核素標(biāo)記物,10,三、示蹤研究的基本類(lèi)型,物理示蹤：所用的放射性標(biāo)記物不是作為體內(nèi)某一特定物質(zhì)的示蹤物，而是追蹤物，不參與化學(xué)反應(yīng)與代謝----研究其重量及物理變化。,化學(xué)示蹤：用于追蹤某種物質(zhì)在體內(nèi)或培養(yǎng)體系內(nèi)的復(fù)雜的生物學(xué)、化學(xué)行為。示蹤標(biāo)記物：可以是待測(cè)物、也可以是待測(cè)物的前體物，結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性相同或相近。,1

6、1,第二節(jié)、示蹤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),基本程序-------- 實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備階段 ---------- 正式實(shí)驗(yàn)階段 ----------- 實(shí)驗(yàn)總結(jié)階段 ------------ 實(shí)驗(yàn)的善后處理階段,12,實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備階段,對(duì)使用的示蹤劑、研究對(duì)象、探測(cè)儀器、實(shí)驗(yàn)用具、收集、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所、安全防護(hù)等條件進(jìn)行準(zhǔn)備------通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢察和完善這些條件----

7、---甚至冷實(shí)驗(yàn)來(lái)掌握與熟悉實(shí)驗(yàn)過(guò)程，并完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。為實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)。,13,正式實(shí)驗(yàn)階段,是實(shí)驗(yàn)研究計(jì)劃與設(shè)計(jì)實(shí)施、完成的階段-----按具體的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行-----作好記錄-----步驟、結(jié)果、意外。,14,實(shí)驗(yàn)總結(jié)階段,按照設(shè)計(jì)的要求認(rèn)真檢查與歸納原始的資料，使其系統(tǒng)化、條理化------清除、減少由于整理數(shù)據(jù)引入的誤差-----統(tǒng)計(jì)----結(jié)論。,15,實(shí)驗(yàn)的善后處理階段,示蹤實(shí)驗(yàn)不同于一般實(shí)驗(yàn)，尤其是放射性示蹤實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生的

8、各種放射性廢物必須妥善處理，要嚴(yán)格按照放射性廢物處理的國(guó)家規(guī)定來(lái)執(zhí)行，嚴(yán)防事故發(fā)生。,16,2.示蹤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本要求,①放射性示蹤實(shí)驗(yàn)的 基本要求②穩(wěn)定性核素示蹤實(shí)驗(yàn)的 基本要求,17,放射性示蹤實(shí)驗(yàn)的 基本要求,A.放射性核素的選擇：實(shí)驗(yàn)要求+核素性質(zhì)基本原則 輻射類(lèi)型：?衰變核素、?-和? 半衰期：適當(dāng)?shù)陌胨テ?，長(zhǎng)要滿足實(shí)驗(yàn)過(guò)程短要便于處理要考慮生物半衰期 1/Te=1/Tp+1/Tb如果Tp 與Tb 相差20

9、倍以上時(shí)， Te約為其中的較短的半衰期,18,,B.放射性核素標(biāo)記的位置研究物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律-----去向---標(biāo)記原子要牢固，位置不要求。研究某個(gè)基團(tuán)的變化代謝時(shí)------標(biāo)記于特定的基團(tuán)上。,19,,C.示蹤劑的要求有足夠的放射性核素純度>98%放射化學(xué)純度>95%放射性比活度高、無(wú)載體,20,,D.示蹤劑劑量的選擇,標(biāo)記物的放射性比活度放射性核素的 半衰期標(biāo)記物在被觀察系統(tǒng)中被稀釋的程度標(biāo)記物在被觀察

10、系統(tǒng)內(nèi)的利用率標(biāo)記物在被觀察系統(tǒng)內(nèi)分布、排泄特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)周期、儀器的探測(cè)效率示蹤劑的化學(xué)毒性（安全劑量）要求：稀釋后，樣品的脈沖計(jì)數(shù)率>5倍本底 >B小動(dòng)物7.4—18.5KBq(0.2—0.5uCi) 可達(dá)370KBq（10uCi）離體<37KBq（1uCi）,21,例,主要觀察組織中標(biāo)記物的分配約為輸入總量的1%，要觀察10天，估計(jì)在此期間標(biāo)記物從該組織消失量為最初的

11、90%，取組織為該組織的10%，測(cè)量上可知最小可測(cè)的放射性=500 DPM，估算所需劑量。,22,,10%組織：500DPM*100/10=500090%消失：5000/10%=50000（開(kāi)始事該組織的總放射性）1%的分配量：50000/1%=5000000 DPM=2.25uCi=83.5KBq,23,,F.示蹤劑給予途徑：口、腹腔、皮下、肌注、靜脈滴注、靜脈一次性推注G.樣品的采集與制備：代表性、污染的防止H.測(cè)量方法的選

12、擇： ? NaI 晶體閃爍計(jì)數(shù)器，32P-----G-M管，3H和14C-----液閃和核乳膠.,24,穩(wěn)定核素實(shí)驗(yàn)的基本要求,核素選擇：2H，13C，15N，18O示蹤劑量：劑量大，可達(dá)化學(xué)劑量豐度：較高的豐度的示蹤物,25,二、示蹤實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法,離體實(shí)驗(yàn)；從整體分離出來(lái)的簡(jiǎn)單系統(tǒng)：細(xì)胞株，無(wú)細(xì)胞酶系統(tǒng)，短期培養(yǎng)的細(xì)胞懸液，切片、器官灌注。用途：揭示物質(zhì)轉(zhuǎn)化規(guī)律，精細(xì)的結(jié)構(gòu)與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及攝取的關(guān)系，是物質(zhì)代謝、受體配體

13、研究的首選。,整體實(shí)驗(yàn)：將示蹤物引入完整的機(jī)體內(nèi)，從體外觀察或定期取標(biāo)本觀察標(biāo)本的去向，以了解物質(zhì)在體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)化規(guī)律。用途：研究物質(zhì) 的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄等或?qū)δ承┢鞴俚墓δ苎芯?。能反映機(jī)體的實(shí)際生理情況—作離體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。,26,,優(yōu)點(diǎn)：1.系統(tǒng)簡(jiǎn)單，示蹤物極其轉(zhuǎn)化物濃度不會(huì)遇到轉(zhuǎn)運(yùn)排泄等復(fù)雜因素的影響，對(duì)結(jié)果的分析比較單純，靈敏度也高。2.實(shí)驗(yàn)條件可以人為加以控制，便于進(jìn)行各種精細(xì)的分析性研究缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)條件與整體差別大，得出

14、的結(jié)論不一定反映實(shí)際情況，要用整體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。,優(yōu)點(diǎn)：能反映機(jī)體的實(shí)際生理情況—作離體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。缺點(diǎn)：不精細(xì),27,離體實(shí)驗(yàn),恒量標(biāo)記實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)中加入過(guò)量的示蹤劑，實(shí)際示蹤劑消耗量小，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，示蹤劑濃度變化小。不須考慮示蹤劑的濃度變化。DNA合成,脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)只允許被研究系統(tǒng)與示蹤劑接觸短暫時(shí)間，隨后將示蹤劑除去，再繼續(xù)觀察。常用于細(xì)胞的 增殖動(dòng)力學(xué)研究，活性肽的代謝研究。,28,整體實(shí)驗(yàn)的給藥途徑,如研究吸收途徑，則選擇不同

15、途徑給予示蹤物。一般采用靜脈注射（小動(dòng)物可腹腔注射）又分為一次性快速推注和恒速滴注。,29,,靜脈注射方式分一次性快速注射和恒速滴注兩種。示蹤劑的濃度在血液和組織或代謝物中都呈現(xiàn)出時(shí)相變化（圖12·1，圖12·2），這是機(jī)體內(nèi)復(fù)雜代謝過(guò)程綜合影響的結(jié)果；血液中示蹤物的濃度不僅取決于它的吸收，也取決于它在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化和排泄。,圖12-1 靜脈一次性快速注射放射性示蹤劑在血液（—·—）、組織（－－－）、代謝

16、物（……）中的時(shí)相變化,圖12-2 靜脈恒速滴注放射性示蹤劑在血液（—·—）、組織（－－－）、代 謝物（……）中的時(shí)相變化,30,整體實(shí)驗(yàn)特點(diǎn),整體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一個(gè)綜合性的結(jié)果血漿中示蹤物濃度取決于：代謝轉(zhuǎn)化、排泄、體內(nèi)的反饋組織中的示蹤物的濃度取決于組織攝取、代謝和釋放的速度，血中示蹤物濃度。研究代謝轉(zhuǎn)化速度時(shí)，必須同時(shí)考慮標(biāo)記前身物和標(biāo)記物的比活度，前者對(duì)后者有直接的影響。,31,三、示蹤實(shí)驗(yàn)資料的整理與分析,一般而

17、言，須在確保標(biāo)記物起到真正的示蹤作用，量具與探測(cè)儀器精度高，嚴(yán)格控制各種變異因素和測(cè)量數(shù)據(jù)可靠的前提下，才能對(duì)示蹤實(shí)驗(yàn)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。注意：兩個(gè)計(jì)數(shù)率的顯著性檢驗(yàn) 可疑值的舍取 誤差傳遞,32,四、數(shù)據(jù)表示方法的選擇,整個(gè)臟器的總放射性活度放射性含量dpm/mg or ml組織或體液比活度dpm/mmol or mg化合物相對(duì)比活度：兩個(gè)解剖部位中同一化合物比活度的比值，兩種化合

18、物（前身與產(chǎn)物）的比活度的比值（或豐度）。,33,第三節(jié)、雙標(biāo)記示蹤實(shí)驗(yàn),原理與用途用同種或不同種的核素標(biāo)記同種分子不同部位或不同種分子進(jìn)行示蹤實(shí)驗(yàn)，追蹤不同的標(biāo)記原子得到所需的信息。,34,,,含示蹤物A的標(biāo)本中加入示蹤物B，活度為DB,勻漿、提取、制樣,雙標(biāo)記測(cè)量，測(cè)得活度DA’和DB’,標(biāo)本中示蹤物A的活度DA=DA’/回收率（%）,回收率（%）=DB’/DB,,,,,35,用途：在物質(zhì)代謝中的應(yīng)用廣泛,研究分子內(nèi)兩部分的代謝規(guī)

19、律研究同種分子處于不同形態(tài)時(shí)的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)化規(guī)律（在同一動(dòng)物個(gè)體或試管中進(jìn)行使 各種動(dòng)物個(gè)體差異減至最小）。不同物質(zhì)運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)化規(guī)律的比較觀察,36,雙標(biāo)記示蹤實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì),標(biāo)記化合物：一般不要單分子內(nèi)雙標(biāo)記化合物，而要兩種單標(biāo)記物混和作雙標(biāo)記物的示蹤劑，成對(duì)的核素有：3H----14C，3H、14C---32P， 32P—45Ca,3H、14C、32P---125I，24Na—36Cl,55Fe—59Fe,125I—131I，放射性---穩(wěn)定

20、同位素一般要求：能量可以區(qū)分開(kāi),37,示蹤劑劑量的配比,兩種標(biāo)記放射性核素發(fā)出的能量不同按照兩種放射性核素各自的探測(cè)效率不同和在體內(nèi)消失的速度估算所需用量要預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,38,雙標(biāo)記測(cè)量,液體閃爍測(cè)量----能閾的不同雙標(biāo)記不同的半衰期核素射線種類(lèi)不同穩(wěn)定核素,39,第四節(jié)、同位素效應(yīng)Isotope effect,概念：由于同位素質(zhì)量的不同而引起的物質(zhì)反應(yīng)速度的變化稱(chēng)為同位素效應(yīng).一般1H、2H、3H同位素效應(yīng)強(qiáng)，質(zhì)量差別大。

21、,40,同位素效應(yīng)的類(lèi)型,初級(jí)同位素效應(yīng)primary isotope effect：同位素所在斷裂而產(chǎn)生的效應(yīng)，嚴(yán)重。次級(jí)同位素效應(yīng)secondary isotope effect: 同位素所在部位的鄰近化學(xué)鍵發(fā)生斷裂。溶液同位素效應(yīng)：溶液中某種原子被其同位素取代，引起反應(yīng)速度下降。H2O—D2O,41,生物體系中的同位素效應(yīng),整體和離體中均存在同位素效應(yīng)20-30%D2O養(yǎng)動(dòng)物-----病理變化30-35% D2O養(yǎng)動(dòng)物--